Bt抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的变化

采用酶特异性底物测定了3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫品系幼虫中肠蛋白酶活性的最适pH值.结果表明,3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫中肠总蛋白酶活性最适pH值均为10.5;强碱性类胰蛋白酶活性最适pH值除3龄Bt抗性幼虫为8.0外,其余均为10.5;弱碱性类胰蛋白酶活性的最适pH值为8.0;类胰凝乳蛋白酶的最适pH值除5龄Bt抗性幼虫的为8.0外,其余都为8.5.比较了最适pH值条件下,3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫中肠蛋白酶活性的差异.发现3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫中肠总蛋白酶活力差异不显著;两个品系3龄幼虫中肠强碱性类胰蛋白酶活性差异达到极显著水平,5龄幼虫中肠强碱性类胰蛋白酶活性差异不明显;两个品系3龄幼虫中肠弱碱性类胰蛋白酶活力差异没有达到显著水平,而5龄幼虫弱碱性类胰蛋白酶活力差异极显著;另外,3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫类胰凝乳蛋白酶活力差异极显著.棉铃虫幼虫中肠酸碱强度和某些蛋白酶活性的变化,可能是造成棉铃虫抗性演化的因素之一.图2表1参17     

转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂生长发育的影响

研究了取食转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂的影响,主要包括意大利蜜蜂的生长发育、体内酶活性的变化.结果发现,取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂与取食非转基因亲本棉花花粉的蜜蜂(CK)相比,4、5、6日龄幼虫体重差异不显著,幼虫及蛹的历期也没有明显差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂6日龄幼虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶、总蛋白酶活力与CK相比,没有显著差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶活力极显著高于CK,强碱性、弱碱性类胰蛋白酶活力极显著低于CK,类胰凝乳蛋白酶活力显著低于CK.另外,采用酶联免疫(ELISA)方法在取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的蜜蜂6日龄幼虫体内能够检测到Bt杀虫蛋白.表4参12     

蛋白酶抑制剂对杨扇舟蛾的中肠蛋白酶作用的研究

研究了杨扇舟蛾幼虫的中肠几种主要蛋白酶活性．以14C-酪蛋白为底物测定的总消化酶活性在碱性缓冲液中最高；特异蛋白酶抑制剂研究表明：只有丝氨酸蛋白酶抑制剂对中肠蛋白酶活性有抑制作用，其它的特异蛋白酶抑制剂如半光氨酸蛋白酶抑制剂、天门冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂对中肠的酶活均无抑制作用，可以认为杨扇舟蛾的中肠蛋白酶以丝氨酸蛋白酶为主．以特异的p－nitroanilide为底物测定胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和亮氨酸蛋白酶活性在碱性缓冲液中最高，且以弹性蛋白酶活性最高．在所研究的23个丝氨酸蛋白酶抑制剂中，抑制作用最强的是马铃薯蛋白酶抑制剂I和南瓜韧皮胰蛋白酶抑制剂．本研究丰富了对杨扇舟蛾的中肠蛋白酶种类的了解，为杨树抗虫基因构建和转化提供了依据．     

菊酯类杀虫剂抗性棉铃虫para型钠离子通道基因的部分序列测定与突变

昆虫神经系统para型钠离子通道是菊酯类杀虫剂的主要靶标，对10多种昆虫的研究表明，钠离子通道基因发生点突变与昆虫对菊酯类杀虫剂的抗性密切相关．通过RT-PCR扩增的方法，我们获得了编码溴氰菊酯抗性和敏感品系棉铃虫钠离子通道域Ⅱ-Ⅳ的cDNA片段．核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析结果表明，溴氰菊酯抗性品系棉铃虫钠离子通道基因不存在其它昆虫中报道的kdr和super-kdr抗性突变，但是我们发现了一个甲硫氨酸(M)到亮氨酸(L)的新突变，该突变位于域Ⅱ和Ⅲ之间．由于昆虫钠离子通道高度保守，因此，该突变很可能与棉铃虫对溴氰菊酯的抗性有关．另外，通过PCR扩增的方法，克隆了棉铃虫钠离子通道域Ⅱ-Ⅳ的基因片段，该片段全长7334bp，包含有13个外显子和12个内含子，与果蝇和烟蚜夜蛾相比，内含子在基因中的位置基本一致，进一步表明昆虫钠离子通道基因在进化过程中高度保守．图5表1参22     

污泥堆肥过程中磺胺类和大环内酯类抗性基因的残留

抗生素抗性基因是一种新型环境污染物,污水处理厂特别是污泥中存在着高丰度的抗生素抗性基因.为研究污泥堆肥过程中抗生素抗性基因的残留,对磺胺类和大环内酯类抗性基因(sulI、sulII、erm(B)和erm(F))以及I类整合子(intI1)的丰度变化进行了定量分析.结果显示,sulΙ、sulΙI、erm(B)和erm(F)的相对丰度在中温阶段降低(PsulII0.05,Perm(B)0.05,Perm(F)0.05),且sulΙ的相对丰度在高温阶段达到最小值(PsulI0.05),sulΙ、sulΙI和erm(F)的相对丰度在冷却和腐熟阶段增加(PsulI0.05,PsulII0.05,Perm(F)0.05).堆肥过程中sulΙ、sulII和erm(B)的丰度与温度呈负相关(P0.05),温度可能是影响磺胺类和大环内酯类抗性基因变化的重要因素.sulΙ和sulII的丰度与intI1的丰度呈正相关(P0.05),表明水平基因转移可能是该类抗性基因传播与扩散的重要途径.研究结果表明,尽管存在于污泥中的抗生素抗性基因的相对丰度在升温阶段呈下降趋势,但在随后的冷却和腐熟阶段却显著反弹.因此,经堆肥处理的污泥直接施用于农田可能造成抗生素抗性基因的二次扩散.     

响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析

短小芽孢杆菌SCU11是由本实验室分离的野生菌株BA06经过复合诱变得到的高产碱性蛋白酶菌株,其产生的碱性蛋白酶在生物制革领域具有很好的应用前景.为进一步提高菌株的蛋白酶产量以满足工业生产的需求,本研究利用响应面法优化菌株产蛋白酶的发酵培养条件.在前期单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、中心组合实验设计和响应面分析法,确定了当黄豆粉浓度为53.3 g/L,温度为28℃时,蛋白酶活有理论最大值8 884 U/m L,摇瓶实验验证酶活为8 768 U/m L,达到理论预测值的98.7%,比优化前酶活提高了1倍.为了解优化的发酵条件使蛋白酶产量提高的原因,对短小芽孢杆菌蛋白酶基因及相关调控基因的表达情况进行荧光定量PCR分析,结果显示,优化后5种蛋白酶基因的表达量上调,1种表达量下调;5种蛋白酶相关调控基因的表达量增加,2种基因表达量降低.推测是优化后正调控基因表达量的增加以及负调控基因表达量的降低,促进了短小芽孢杆菌胞外蛋白酶基因转录水平的提高,导致胞外蛋白酶产量增加.本研究采用响应面法优化发酵条件使短小芽孢杆菌SCU11蛋白酶产量提高了1倍,并为阐明其表达调控机制奠定了基础.(图3表7参24)     

多效唑在鱼体内的分布,积累与类脂质含量相关性研究

实验水系统中，植物生长调节剂多效唑在鲤科类金鱼体内分布、积累的研究结果表明，＾３Ｈ－ＭＥＴ主要积累在鱼体消化系统；各器官／组织的积累量依次为：肠＞肝＞鳃＞皮＞肉＞骨；多效唑效生物积累因子（ＢＣＦ）和鱼体类脂质含量之间有较高的正相关性。     

球孢白僵菌胞外蛋白酶及类枯草杆菌蛋白酶的诱导

研究了接种物和诱导物对球孢白僵菌总胞外蛋白酶及类枯草杆菌蛋白酶（Ｐｒ１）产生的影响。结果表明，球孢白僵菌不同接种物产生的总胞外蛋白酶及Ｐｒ１活性有明显差异；不同诱导物对产酶水平也有较大影响。其中芽管状物在蝉蜕诱导液中的总胞外蛋白酶和Ｐｒ１活性均最高，诱导１２ｈ酶活性达高峰，不同来源的菌丝产酶水平有差异，在诱导液中，接种物总胞外蛋白酶和Ｐｒ１的变化趋势一致，但总胞外蛋白酶活性和Ｐｒ１活力间没有直接的     

嗜水气单胞菌感染影响中国大鲵核因子45和90表达

为研究中国大鲵核因子45(NF45)和90(NF90)对嗜水气单胞菌感染的免疫响应,通过腹腔注射的方式感染健康的中国大鲵,并在感染后0、12、24、36和48 h分别收集大鲵不同组织,通过qPCR检测NF45和NF90在各个组织中的表达情况.结果显示,核因子NF45和NF90在正常大鲵的所测组织中均有表达,其中NF45基因的相对表达量在大鲵肌肉、胃、心脏和脾脏中保持较高水平,而在肝脏中的表达水平最低,并且心脏中的相对表达量约为肝脏中的5.57倍;而NF90基因的相对表达量在大鲵心脏、皮肤、肌肉和脾脏中保持较高水平,而在肠中的相对表达水平最低,其中心脏中的相对表达量约为肠中的6.27倍.在接种嗜水气单胞菌24 h后,大鲵皮肤、肝、脾和肾中的NF45相对表达水平明显上升,并且NF45在皮肤中的相对表达量是肠的6.55倍;而NF90的相对表达量在接种后也明显上升,并且在脾脏中的相对表达量是肠的9.28倍.NF45和NF90在皮肤、脾、肾和肝中的相对表达量随时间变化均呈现先升高后下降的趋势.在肝和肾组织中,NF45和NF90基因的相对表达量均在大鲵染菌24 h时达到最大值,而在脾组织中,均在大鲵染菌36 h时达最大值.在皮肤组织中,NF45的相对表达量在大鲵染菌24 h时达到最大值,而NF90在大鲵染菌12 h时达最大值.本研究表明在嗜水气单胞菌的刺激下,NF45和NF90均作出积极响应,结果可为研究NF45和NF90调控大鲵免疫响应机制提供重要的理论基础.(图6表1参49)     

种子特异启动子At2S3驱动热激转录因子AtHsfA6a提高烟草热抗性

特异启动子指导外源基因在某一特定时空表达,避免个体多余营养的浪费,在作物品质及逆境适应性改良中具有重要应用潜力.采用种子特异启动子联合抗性基因的方法,对拟南芥种子特异启动子At2S3和热激转录因子At Hsf A6a进行克隆,构建p BI121双元表达载体(p At2S3::At Hsf A6a),利用农杆菌菌株转化烟草,获得转基因烟草稳定株系,并进行种子抗高温胁迫萌发实验.结果显示:At Hsf A6a表达量随高温胁迫持续而不断积累,45℃高温处理后,热激转录因子At Hsf A6a的表达量最高上调28倍.转基因烟草株系(L2,L3)与野生型烟草(WT)相比,在45℃高温处理12 h、18 h和24 h后,最终萌发率分别为100%、98%和80%,98%、94%和76%以及97%、92%和70%.根长实验表明转基因株系L2和L3的根长为未处理时的74%和60%,而WT根长为未处理时的52%.上述结果说明超表达烟草株系的萌发和根系生长较之WT对热激处理更不敏感,呈现出更高的抗性;可为种子特异启动子加抗性基因的组合提高转基因植株抗胁迫能力提供直接实验证据,为基因工程育种提供种子特异启动子和抗胁迫新策略.     

湿害处理对不同生育时期芝麻叶片保护酶活性和种子产量的影响

对蕾期、盛花期和终花期的芝麻品种进行了24～60 h的湿害处理.测定了叶片保护酶(POD、SOD、CAT)、植株萎蔫率、死株率等14个性状.结果表明,蕾期和盛花期芝麻叶片中保护酶SOD、POD和CAT活性随着湿害处理时间的延长均呈先升后降的趋势,品种间存在差异.蕾期和盛仡期湿害处理对芝麻生长速率、植株萎蔫率和死株牢影响较大,尤以盛花期最为严重.3个生育时期的芝麻品种受湿害处理后均蒴果数减少、种子产量降低、根系早衰甚至烂根.芝麻叶片保护酶活性与植株萎蔫率、死株率旱显著或极显著负相关,与生长速率、有效蒴果数等9个考察性状呈正相关,且大部分相关系数达到显著或极显著水平.综合各项考察指标,湿害处理对芝麻盛花期影响最为严重,K36 h是多项指标发生急剧变化或转折的敏感时间,湿害后的表现型性状变化趋势与叶片保护酶活性变化趋势在品种间基本一致.图4表1参23     

Glutathione S-transferase in the branchiopod<Emphasis Type="Italic"> Artemia salina</Emphasis>

The glutathione S-transferase enzyme system, which belongs in phase II of detoxification, has been studied in developmental stages of the branchiopod Artemia salina. The highest total activity and specific activity towards 1-chloro-2,4-dinitrobenzene was observed 48 h after hatching. The number of isoenzymes present in A. salina varies between three and four, depending on the developmental stage. The two major isoenzymes, with corresponding isoelectric points of 8.5 and 7.2, were present in all developmental stages, but at a varying rate: as the organism grew older, the alkaline isoenzyme was expressed at a higher rate. The kinetic and molecular characteristics of the enzyme were similar to those of other aquatic organisms. With regards to the kinetic characteristics, significant differences were observed between the two major isoenzymes, and, since the rate of their expression changes as the organism grows, the detoxification potential of the organism varies according to developmental stage.Communicated by O. Kinne, Oldendorf/Luhe     

Ontogenetic variation in digestive proteinase activity of larvae and postlarvae of the pink shrimp Farfantepenaeus paulensis (Crustacea: Decapoda: Penaeidae)

Proteinase (endopeptidase), trypsin-like and chymotrypsin-like activities were examined throughout the ontogenetic development of cultured Farfantepenaeus paulensis. Whole individuals from different larval and postlarval stages, and the hepatopancreas of adults were homogenized and assayed to quantify the enzyme activities of specific substrates. Proteinase activity was identified by substrate-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Specific inhibitors for trypsin (TLCK), chymotrypsin (TPCK) and serine proteinases (PMSF) were used to identify activity zones of these enzymes in gels. Protein-specific activity of total proteinases, trypsin and chymotrypsin was negligible at the egg stage and at Nauplius III, increasing in the first protozoeal substage (PZ I), and reaching a peak at PZ III; it decreased again in the subsequent postlarval substages. Different patterns of proteinase activity were observed in SDS-PAGE zymograms during ontogenetic development. Active bands of 14.6, 16.4, 17.5, 19.5, 22.5, 23.9, 25.8, 28.9, 32.0, 34.4, 37.7, and 42.2 kdaltons were detected in the adult hepatopancreas. Proteolytic activity was detected on gels in PZ I, and intense activity zones of 16.4, 17.5 and 19.5 kdaltons were found up to Mysis I (M I). Intense bands of 39.1 and 53.5 kdaltons were observed only at PZ III and M I. Band-activity intensity decreased after metamorphosis to the postlarval stage (PL). The chymotrypsin inhibitor TPCK had no effect on the proteinase bands. Active zones in gel inhibited with both TLCK and PMSF were considered to represent trypsin. The inhibitory effect of PMSF alone on proteinase extracts indicated chymotrypsin activity. TLCK and PMSF inhibition also varied during ontogenetic development. The inhibition of bands recorded between 14.6 and 21.7 kdaltons suggested the presence of low molecular weight trypsin in F. paulensis. The 39.1 kdaltons band observed at PZ III and M I were trypsin-like. On the other hand, bands of 28.9, 32 and 37.7 kdaltons from the adult hepatopancreas seem to represent a chymotrypsin. We conclude that the recorded variation in enzyme activity may be associated with morphological and behavioral changes during penaeid ontogenetic development. The higher enzyme activity at PZ II, PZ III and M I may reflect the increased energy turnover associated with intense swimming behavior and food ingestion. Received: 24 September 1998 / Accepted: 20 August 1999     

转sck单价基因和cry1Ac/sck双价基因水稻对二化螟的致死效应及中肠组织病理变化观察

室内采用离体叶片法研究了转sck单价基因抗虫水稻86AS1和转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻MSB不同生育期主茎顶叶对二化螟幼虫的杀虫效果.结果发现,不同生育期的MSB对二化螟初孵幼虫表现出了很强的毒杀效果,二化螟幼虫校正死亡率在扬花期前均达到90%以上;扬花期和灌浆期抗虫性有所下降,校正死亡率高于80%;成熟期校正死亡率在60%以上.在整个生育期,二化螟幼虫取食86AS1主茎顶叶的校正死亡率均未超过50%.MSB对二化螟幼虫的毒杀效果明显高于86AS1.采用透射电镜观察二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻和转sck单价基因抗虫水稻主茎顶叶后中肠组织的病理变化.结果发现,两种转基因水稻都能够引起二化螟幼虫中肠组织发生病理变化,但病变程度有明显差异.二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻3d,中肠组织受到严重破坏且病理变化明显;取食转sck单价基因抗虫水稻3d,幼虫中肠组织的病理变化却较缓慢.图2参10     

川西亚高山、高山森林土壤微生物生物量和酶活性动态特征

为深入了解川西亚高山/高山森林冬季生态学过程,于2008年11月─2009年10月,在土壤冻结初期、冻结期和融化期及植被生长季节,研究了不同海拔岷江冷杉林（Abies faxoniana）土壤微生物生物量和酶活性动态。各海拔森林土壤在冬季维持着较高的微生物生物量含量和酶活性,并随土壤冻融过程不断变化。土壤有机层和矿质土壤层冬季微生物生物量碳和氮含量及转化酶和尿酶活性均表现出受冻结初期土壤冻融循环影响显著降低,在冻结期变化不明显,在融化期急剧增加至融化后显著降低的趋势,且土壤有机层微生物生物量含量和酶活性在融化期具有一个明显的年高峰值。海拔变化显著影响了土壤酶活性,但对土壤微生物生物量不显著。土壤温度与土壤微生物生物量含量相关显著。这表明季节性冻融期是土壤生态过程的重要时期,土壤冻融格局显著影响川西亚高山/高山森林土壤微生物生物量和酶活性动态。     

毒死蜱对紫金山森林土壤酶活力及微生物毒性影响研究

毒死蜱是有机磷类农药,对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用,在农业虫害防治中应用广泛。为掌握毒死蜱对森林土壤酶活力和土壤微生物生态效应,选择紫金山森林土作为受试土壤,采用室内培养法,研究了毒死蜱对土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶,以及土壤呼吸强度和氮素硝化作用的影响。结果表明:试验期间,1.25 mg a.i.·kg-1、12.5 mg a.i.·kg-1和125 mg a.i.·kg-1毒死蜱对土壤脲酶、酸性磷酸酶总体表现为抑制作用;对土壤蔗糖酶和过氧化氢酶的影响与暴露剂量和暴露时间有关,在60 d时,Z1低剂量处理组(1.25 mg a.i.·kg-1)蔗糖酶和过氧化氢酶可恢复,Z100高剂量处理组(125 mg a.i.·kg-1)抑制作用不能解除。试验初期,毒死蜱对土壤呼吸强度有一定刺激作用随后逐渐恢复;对土壤氮硝化作用影响表现为先促进后抑制,且抑制作用有长期影响。由此可知,毒死蜱使用对紫金山森林土的土壤酶活性和土壤微生物产生毒性效应,具有一定生态风险。     

粉煤灰结合施肥对土壤微生物和酶活性的效应

在以前对粉煤灰改良石灰性土壤对其理化性质和养分效应研究的基础上，分析了小麦不同生育期土壤中微生物数量和几种重要的土壤酶的活性，旨在探讨石灰性褐土施用粉煤灰配合有机肥对土壤环境生物质量的效应。结果表明，每公顷施用粉煤灰150t以上显著提高了土壤中各种微生物的数量，对土壤酶活性也有显著的作用，尤其是对小麦灌浆期脲酶的活性有显著的促进作用。因此，施用粉煤灰可以改善土壤的生物活性，从而达到保护和治理土壤环境的效果。     

环境化学致癌物联苯胺和六氯苯对大鼠肝线粒体酶活性的影响（Effects of Environmental Chemical Carcinogens Benzidine and 1,2,3,4,5,6-Hexachlorocyclohexane on Enzyme Activities of Rat Liver Mitochonria）

采用不同浓度(50、100、200mg·kg-1)的联苯胺(Benzidine)和不同浓度(200、400、800mg·kg-1)的六氯苯(1,2,3,4,5,6-Hexachlorocyclohexane),通过对大鼠进行体内染毒建立毒性作用动物模型,分析了大鼠肝脏线粒体抗氧化物酶及呼吸代谢和能量转换酶(SOD、GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase)活性的变化.结果表明,在低浓度联苯胺(50mg·kg-1)和六氯苯(200mg·kg-1或400mg·kg-1)作用下酶活性出现应激反应,而高浓度联苯胺(100、200mg·kg-1)和六氯苯(800mg·kg-1)则显示出明显的抑制作用.分析认为,联苯胺和六氯苯可能经体内代谢活化后,对线粒体DNA及其转录和翻译系统产生作用,导致线粒体代谢功能紊乱,这可能是联苯胺和六氯苯毒性作用对线粒体损伤的主要机制.     

禾谷孢囊线虫侵染对小麦根部防御酶的影响

以抗禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wollenweber,cereal cyst nematode,CCN)小麦品系‘E-10’和易感材料‘中国春’为材料,通过人工接种禾谷孢囊线虫二龄幼虫,并在接种线虫后测定根部防御酶苯丙氨酸转氨酶(PAL)和脂氧合酶(LOX)活力变化,研究抗感性材料对线虫侵染后防御酶的响应,以了解作物的抗虫机制.结果发现,‘E-10’和‘中国春’防御酶活力变化存在显著差异,‘E-10’在线虫侵染后6 h,LOX酶活增强,在24 h达到最大值,酶活变化比‘中国春’迅速,暗示‘E-10’启动线虫防御反应更为有效直接.此外,发现小麦在接种线虫后会引起邻近未接种植株根部防御酶活力变化.‘E-10’在接种线虫后12 h,其接触组未接种材料根部PAL酶活增加0.9倍,LOX酶活增加1.1倍,并且‘E-10’未接种植株的酶活变化比‘中国春’更迅速,幅度更剧烈.表明可能有某些气态或挥发性物质参与了小麦防御线虫侵染过程,并且这种现象在抗感材料间差异显著.使用茉莉酸甲酯处理‘E-10’和‘中国春’,小麦根部PAL和LOX酶活并未产生与接触接种线虫材料相一致的变化,表明该气态或挥发性物质并非茉莉酸甲酯.