水产养殖环境中抗生素抗性基因（ARGs）的研究及进展(Research Advancement of Antibiotics Resistance Genes（ARGs）in Aquaculture Environment)

抗生素在现阶段的水产养殖中具有不可替代的作用,但长期滥用抗生素会诱导水生动物体内产生携带抗性基因(ARGs)的细菌株,尤其是多重耐药性菌株的产生将使得各种疾病的治疗更加棘手.抗性基因一旦被排泄到水产环境中不仅会对养殖区域和周围的环境造成潜在的基因污染,而且还会通过各种可移动遗传元件如质粒、转座子、整合子等的水平迁移作用进入其他致病菌和环境细菌中,对人类的健康安全构成潜在的威胁.论文对抗生素抗性基因在水产养殖业中的来源、污染现状、潜在的传播途径和相关的检测方法进行了综述,指出了开展水产养殖业中抗生素抗性基因污染研究的必要性,建议政府和有关部门尽快进行水产养殖业抗生素抗性基因的污染机理与控制对策研究.     

城市垃圾填埋场抗生素抗性基因的污染特征

抗生素抗性基因是一种新型的环境污染物,为探究抗生素抗性基因在垃圾填埋场的污染特征,采集上海老港垃圾填埋场中固体垃圾和渗滤液样品,采用实时荧光定量PCR技术检测磺胺类抗生素抗性基因(sul1、sul2)、四环素类抗性基因(tetM、tetQ)、氨基糖苷类抗性基因(strB、aadA1)、大环内酯类抗生素抗性基因(ermB、mefA)、多重抗性基因(mexF)及I类整合子(intl1)等6类目标基因的丰度.结果显示,6类目标基因均在固体垃圾和渗滤液中检测到,丰度分别介于10~2-10~6、10~3-10~7/ng,且多重抗性基因、氨基糖苷类及磺胺类抗生素抗性基因检出丰度较高.在填埋场固体垃圾中,部分目标基因在1.5 m深处的丰度高于0.5 m深处;在渗滤液中,目标基因丰度和呈现老龄渗滤液大于新鲜渗滤液,部分目标基因在秋季的丰度大于春季.上述结果说明垃圾填埋场是抗生素抗性基因潜在的储存库,目标基因的丰度在垃圾填埋场中存在时空差异.(图8表2参41)     

华中地区水库型水源地抗生素抗性细菌的赋存特征研究

抗生素的滥用导致了细菌耐药性的变化,而水库型水源地抗生素抗性细菌(Antibiotic resistant bacteria,ARB)与人类健康密切相关。为明确华中地区水库型水源地中ARB的赋存特征,选取华中地区11个大型水库型水源地为研究对象,分析了5类ARB在水和沉积物中的分布规律。结果表明,华中地区水库型水源地水和沉积物中,丰度最高的ARB均以四环素类ARB及磺胺类ARB的丰度最高,喹诺酮类ARB在本研究最低。Mantel分析结果表明,沉积物和上覆水中ARB丰度呈显著性正相关(P0.05),沉积物和水中的物质交换可能是导致这一结果的重要因素。Spearman相关性分析结果表明ARB之间存在一定的相关性,抗生素的共选择作用可能是造成这一结果的潜在因素。研究中筛选的条件致病菌分别对多种抗生素均具有抗性,可能会对人体健康产生潜在威胁。此外,虽然该研究的结果表明水库沉积物在一定程度上受到粪源污染,但华中地区水库环境较低的总异养菌数和饮用水厂较高的细菌去除效率在一定程度上能够保证供水质量。     

快速评估近岸海洋水体与沉积物中E.coli与S.aureus抗生素抗性水平的新方法

随着抗生素抗性污染日益严重,快速评估环境中典型病原菌与条件性致病菌的抗生素抗性水平,对掌握区域环境抗生素抗性污染状况、揭示抗性污染传播规律至关重要。通过以最低抑菌浓度浸入抗生素改进MI、VJ培养基,并结合滤膜法,建立了针对近岸海洋环境中指示性病原微生物大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的抗生素抗性监测方法。水体和沉积物样品抗生素抗性水平评估实验结果显示,该方法具有较好重现性(水体和沉积物中E.coli和S.aureus抗生素抗性水平的相对标准偏差分别为11%、8%)与准确度(水体和沉积物中E.coli和S.aureus的平均回收率分别为83.5%、68.4%;相对于CLSI药敏试验的偏离度为±0.1)。且与CLSI药敏实验相比,该方法过程简便、耗时短(36 h/84 h),能最大限度节约经济和人员成本提高抗性评价效率。应用该方法评估辽河口与莱州湾环境中2种病原微生物磺胺类抗生素抗性水平,结果显示辽河口水体中E.coli和S.aureus磺胺二甲嘧啶的平均抗性率分别为27.0%、28.4%,沉积物中分别为35.5%、34.6%;莱州湾水体中E.coli和S.aureus磺胺二甲嘧啶的平均抗性率分别为26.0%、14.5%,沉积物中分别为12.0%、32.9%。该方法适用于河口、近岸海洋及入海排污口水体与沉积物样品中E.coli与S.aureus的快速分析及抗生素抗性水平评估。     

污泥堆肥过程中磺胺类和大环内酯类抗性基因的残留

抗生素抗性基因是一种新型环境污染物,污水处理厂特别是污泥中存在着高丰度的抗生素抗性基因.为研究污泥堆肥过程中抗生素抗性基因的残留,对磺胺类和大环内酯类抗性基因(sulI、sulII、erm(B)和erm(F))以及I类整合子(intI1)的丰度变化进行了定量分析.结果显示,sulΙ、sulΙI、erm(B)和erm(F)的相对丰度在中温阶段降低(PsulII0.05,Perm(B)0.05,Perm(F)0.05),且sulΙ的相对丰度在高温阶段达到最小值(PsulI0.05),sulΙ、sulΙI和erm(F)的相对丰度在冷却和腐熟阶段增加(PsulI0.05,PsulII0.05,Perm(F)0.05).堆肥过程中sulΙ、sulII和erm(B)的丰度与温度呈负相关(P0.05),温度可能是影响磺胺类和大环内酯类抗性基因变化的重要因素.sulΙ和sulII的丰度与intI1的丰度呈正相关(P0.05),表明水平基因转移可能是该类抗性基因传播与扩散的重要途径.研究结果表明,尽管存在于污泥中的抗生素抗性基因的相对丰度在升温阶段呈下降趋势,但在随后的冷却和腐熟阶段却显著反弹.因此,经堆肥处理的污泥直接施用于农田可能造成抗生素抗性基因的二次扩散.     

粪肥与铜一次性施用对农田土壤抗生素抗性基因的长期影响

人类农业生产活动显著影响农田生态系统中抗生素抗性基因的增殖与扩散,为探究粪肥与铜施加对土壤抗生素抗性基因增殖与传播的长期影响,采用高通量荧光定量聚合酶链式反应分析猪粪和铜停施10年后土壤中抗生素抗性基因多样性和丰度.结果显示:猪粪和铜停施10年后,土壤抗生素抗性基因相对丰度仍分别处于2.16倍和2.01倍于对照组的较高水平,说明猪粪和铜施用可导致土壤抗生素抗性基因的长期存在,其中ycel_mdtH和cphA基因在猪粪和铜施用两种处理中均显著富集. PCA结果显示,猪粪和铜处理土壤中抗生素抗性基因的分布格局无明显差别,铜处理土壤中所检出的抗生素抗性基因数量的90%以上均可在猪粪施用土壤中检出,而铜是唯一在两种处理土壤中检出浓度均显著高于(P 0.001)对照并处于同一浓度水平的元素.本研究表明铜可能是导致土壤中抗生素抗性基因增殖扩散的主要因素之一,施加重金属含量较高的粪肥对农田土壤抗生素抗性基因有着长期影响的风险;结果可为农业中的粪肥施用提供新的风险评价参数.(图4参26)     

Tet抗性铜绿假单胞菌接合转移pHN102方法研究

二亲本杂交实验通常要求受体菌不能携带有与质粒上相同的抗性.本次实验中受体菌铜绿假单胞菌(Pseudo-monas aeruginosa)和重组质粒pHN102都带有四环素(Tc)抗性.考虑到质粒pHN102导入受体菌后至少带有两个Tc抗性基因片段,转移接合子的抗性会增强,所以提高四环素浓度至20μg/mL,并利用pHN102上携带的luxAB发光酶基因标记受体菌筛选转移接合子,并设立对照菌株.通过抽提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测,确定pHN102成功转入P.aeruginosa中.转移接合子经4次转接后,质粒仍可以稳定存在且能够稳定表达.P.aeruginosa(pHN102)的发光动力学曲线表明,加入底物20min后,发光强度趋于稳定.经液体培养稀释后进行发光度和活菌数测定,发现二者呈显著的线性关系(r=0.994).图4表2参6     

土壤环境中四环素类抗生素残留及抗性基因污染的研究进展(Tetracycline Residues and Tetracycline Resistance Gene Pollution in Soil: A Review)

近年来,致病菌耐药性的增加和扩散已成为全世界关注的热点问题,而人类医疗和畜禽养殖业抗生素的滥用正不断加剧这一问题.众多研究表明土壤环境作为一个巨大的抗性基因储存库,在抗性微生物和抗性基因的传播中起重要的作用,具有潜在的生态与健康风险.在总结国内外最新研究基础上,对土壤环境中典型抗生素-四环素类抗生素的主要污染源以及其在土壤中的基本环境行为等进行了分析,并探讨了土壤中四环素类抗性基因的来源、迁移和扩散及分子检测手段等问题.我国作为抗生素的生产和消费大国,抗生素污染问题较其他国家更为严重,而国内相关研究才刚刚起步,迫切需要开展有关环境中抗生素和抗生素抗性基因污染的系统研究.     

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)工程菌株田间残留和扩散的追踪检测

分别在北京和江苏省连云港市对携带Btcry基因的荧光假单胞菌工程菌进行了田间残留与扩散的追踪检测 .对越冬前后的试验地和保护地土壤样品进行抗生素抗性平板分离 ,能检测到极少量的具有与出发菌株相同抗性的荧光假单胞菌菌落 ,但没有发现工程菌株的残留与扩散 .对江苏试验地样品还进行了工程菌株质粒卡那霉素和壮观霉素抗性标记基因的抗性菌落分离 ,绝大多数样品中都能分离到包括荧光假单胞菌在内的抗性菌落 ,土样中菌密度n(cfu) =10 4 ～ 10 5g-1,但进行Btcry基因PCR -RFLP检测时没有从样品中得到特异扩增产物 .研究结果表明 :工程菌株抗性标记基因在自然界广泛存在 ,工程菌在株环境中没有残留和扩散 ,具有良好的生物安全性 .表 4参 8     

海南东寨港海水和沉积物中抗生素抗性基因污染特征研究

抗生素滥用及其诱导产生的抗生素抗性基因(Antibioticresistancegenes,ARGs)污染已经引起各界的广泛关注。东寨港是海南省重要的滩涂养殖基地,其ARGs的产生、传播和富集都可能对人类及生态健康产生危害。采集该区域海水和沉积物样本各10个,利用LC-MS/MS对海水和沉积物中磺胺类、四环素类、氯霉素类和喹诺酮类等4类15种抗生素进行测定,同时采用RT-PCR阐明了相应的12种ARGs(sul1、sul2、dfr A1;tet A、tet C、tet G、tet M;cata1、cata2、cmle1、cmle3;qnr S)及16S rRNA的分布特征,并对抗生素和ARGs的相关性进行分析。结果显示,所测ARGs在各沉积物样品中的检出率均为100%,海水样品中ARGs的检出率在80%-100%之间。其中,qnr S的检出率最高,存在于所有海水和沉积物样品中,而sul2的检出丰度最高。比较海水和沉积物中ARGs的相对丰度,发现沉积物中ARGs的污染程度高于海水。样品中抗生素总体检出率较低,其中沉积物仅有喹诺酮及磺胺类抗生素被检出,海水中除磺胺类抗生素外其他均未检出。与其他研究相比,该区域ARGs检出水平较高,而抗生素检出水平较低,ARGs含量与抗生素浓度相关性较弱(P0.05),这说明由历史背景诱导产生的ARGs可进行自我扩增而持续存在于环境中。该研究结果可为当地抗生素的安全使用和ARGs的环境风险评价提供重要依据。     

抗生素抗性基因在养殖废水中的分布与去除

畜禽养殖场作为抗生素抗性基因的一个热点区,其产生的废水中存在大量的抗生素抗性基因,直接排放将会污染接受的水体.本研究以微生物固化曝气技术为核心,构建了一个包含沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘的养殖废水处理系统.采用高通量荧光定量PCR技术,探究各种抗性基因在进水、各处理池和出水中的种类、多样性和丰度的变化以及可能的影响因素.研究发现:(1)微生物固化曝气技术能有效降低养殖废水中抗性基因的种类和多样性;(2)该技术也能有效去除养殖废水中抗性基因的绝对丰度,去除率高达93.6%;(3)养殖废水出水中抗性基因绝对丰度仍高于自然水体,其直接排放仍有抗性基因污染风险;(4)畜禽养殖废水中TN和土霉素的含量与许多抗生素抗性基因总丰度存在正相关性.通过对TN和土霉素的去除或者控制使用,可以有效降低养殖废水中的抗性基因.     

施用畜禽粪便有机肥土壤抗生素抗性基因污染状况

为研究施用畜禽粪便有机肥农田土壤中抗生素抗性基因的分布状况,采集北京地区9个长期施用有机肥蔬菜基地的温室和大田土壤,对土壤中的抗生素耐药菌和18种抗性基因进行检测分析。结果表明,温室土壤中四环素耐药菌占总菌数的比例显著高于大田土壤(P0.05),但温室土壤中氨苄西林、磺胺甲恶唑和环丙沙星耐药菌占总菌数的比例均与大田土壤无显著性差异(P0.05)。大田土壤和温室土壤中磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2和四环素类抗性基因tet L的检出率均为100%。其他抗性基因,如四环素抗性基因tet A、tet A/P、tet C,红霉素抗性基因erm B,以及Ⅰ类整合子(intⅠ1),温室土壤的检出率均高于大田土壤,这可能与温室土壤有机肥施用量较大有关。     

莱州湾近岸海域中典型抗生素与抗性细菌分布特征及其内在相关性

为了揭示海陆衔接区环境中抗生素与抗性细菌分布特征及其内在相关性,以莱州湾及其主要入海河流为研究区域,利用HPLC-MS/MS分析样品中15种磺胺类抗生素(SAs)和6种喹诺酮类抗生素(QNs)的浓度,并通过改良的Method 1604(US EPA)评估海水与沉积物中2种典型水传病原微生物大肠杆菌(E.coli)与金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗生素抗性水平,进而探讨该区域水体中抗性菌株的分布特点以及微生物抗性率与相应抗生素浓度的相关性。结果显示,莱州湾水体与沉积物中普遍存在磺胺与喹诺酮类抗生素残留及抗性污染问题。两大类抗生素在水体中平均残留浓度分别为3.89 ng·L~(-1)(SAs)和234.68ng·L~(-1)(QNs),在沉积物中分别为0.91 ng·g~(-1)(SAs)和49.37 ng·g~(-1)(QNs),且分布特征基本呈现自河流向海洋逐渐递减的趋势,说明河流输入是莱州湾抗生素污染的主要来源。在水体中,具有磺胺类抗性的E.coli和S.aureus平均检出量分别达到2 018和4 683 CFU·L~(-1),抗性率范围分别在0%~37.3%和10.6%~45.8%之间;而2种喹诺酮类抗性病原微生物的平均检出量则相对较低,分别为1 315 CFU·L~(-1)(E.coli)和1 461 CFU·L~(-1)(S.aureus),抗性率分别为0%~50.0%和0%~20.8%;此外,相比于E.coli,S.aureus为沉积物中的主要抗性病原微生物,磺胺与喹诺酮类抗性S.aureus检出率均高于80%,平均检出量分别为24CFU·g~(-1)和18 CFU·g~(-1)。相关性分析表明,莱州湾近岸海域水体中磺胺类抗生素浓度与磺胺类抗性微生物总量之间具有良好的线性关系,然而其与微生物抗性率之间并未表现出相似的规律,说明近岸海洋环境中抗生素的残留量不是影响抗性菌株丰度的唯一因素。     

耐药菌的环境分布、传播及新型抗菌技术研究进展

抗生素的广泛使用导致细菌耐药性增加、多重耐药菌菌群数量急剧增多,严重威胁着人类生命健康.环境中耐药菌（ARB）及耐药基因（ARGs）的存在给临床治疗耐药菌感染带来了巨大挑战.有关医院中常见耐药致病菌的研究已有很多,尚缺乏环境中耐药菌的分布、传播及新型耐药菌抗菌技术等的相关研究.本文综述了耐药菌的环境分布特征及其传播机制,概述了新型抗菌技术及其应用,最后展望了有关环境耐药菌研究的未来发展方向.     

黄浦江水域抗生素及抗性基因污染初步研究

采用高效液相色谱-质谱法,调查了黄浦江江水及底泥中6种常见兽用抗生素的含量特征,并采用实时荧光定量PCR方法,分别研究了该水域相应的8种代表性抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes,ARGs)的存在及丰度水平。结果显示,调查的四环素类、磺胺类及氯霉素抗生素在江水中的质量浓度范围分别在0.44～2.69、0.97～1.96、0.03～0.26μg·L-1之间,在底泥中的质量分数则分别为22.10～72.74、25.98～117.29、nd～50.47μg·kg-1。所有样品中除tet(O)、tet(B/P)未检出外,其他6种抗性基因均有检出。与四环素类抗性基因相比,磺胺类抗性基因的绝对拷贝数及相对丰度较高,为黄浦江水域中的优势抗性基因。相关性分析表明:江水中sul(Ⅲ)、tet(W),以及底泥中的sul(Ⅱ)丰度与对应相中磺胺类抗生素含量显著正相关,江水中sul(A)则与水相中氯霉素、四环素含量显著相关,其他几种抗生素与抗性基因间未见相关性存在。除抗生素外,黄浦江水域ARGs的相对丰度还可能与抗性基因种类及其环境因素(如光照、温度、pH和重金属等)有关。     

北黄海近岸海域磺胺类抗生素及其抗性Escherichia coli分布

致病菌耐药性的增加和扩散目前已成为全球公共安全问题,为提供解决该问题的重要理论数据,在我国北黄海近岸海域采集排污口、海水养殖区和海滨浴场等水样和沉积物样品,利用HPLC-MS/MS分析水体样品中14种磺胺类(SAs)抗生素浓度含量,同时根据EPA方法(Method 1604)对水和沉积物中Escherichia coli(E.coli)和磺胺抗性E.coli(Re-E.coli)总量进行测定,计算出E.coli磺胺抗性水平,进而探讨该区域水体中E.coli磺胺抗性率与磺胺类抗生素浓度含量的相关性以及E.coli磺胺抗性菌株的分布特点及来源.结果显示,北黄海近岸海域水体中抗生素检出浓度差异性较大,磺胺浓度含量范围为ND-584.32 ng/L;E.coli和Re-E.coli每100 mL总量范围在27×104-5.5×104和8×104-1.6×104株,在每克沉积物中分别为0-1 363和0-320株;E.coli磺胺抗性率范围为18.18%-66.91%.研究表明,E.coli磺胺抗性率与磺胺类抗生素浓度含量存在显著相关性(P=0.846),说明环境残留抗生素可诱导抗性微生物;E.coli和Re-E.coli分布和抗性水平显示,抗性基因之间存在水平转移,且其主要来源是渔业养殖.     

养殖虾塘常见耐药菌的分离鉴定与耐药基因检测

了解水产养殖区中抗生素耐药菌的分布及抗生素耐药基因的污染现状,有助于科学、合理地使用抗生素。采用诺氟沙星抗性平板和红霉素抗性平板统计虾塘泥样和水样中耐药微生物数量,从中筛选得到60株耐药菌株。基于16Sr DNA序列分析完成部分菌株的鉴定,同时,对耐药菌株携带的喹诺酮类(诺氟沙星)抗性基因gyr A及大环内酯类(红霉素)抗性基因erm B进行了扩增及测序分析。结果表明,虾塘水样细菌在诺氟沙星抗性平板中均未生长,虾塘泥样细菌对诺氟沙星的耐药率分别为0.36%、0.82%;1号虾塘泥样和水样中细菌对红霉素的耐药率分别为23.33%、18.50%,2号虾塘泥样和水样中细菌对红霉素的耐药率分别为20.00%、12.50%。耐药菌16S rDNA鉴定结果如下:南极适冷菌(Rheinheimera sp.)7株、不动杆菌(Acinetobacter sp.)6株、微杆菌(Microbacterium sp.)3株、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)2株、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)2株、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)1株。1号虾塘gyr A检出率为43.33%,erm B检出率为30.00%;2号虾塘gyr A检出率为10.00%,erm B检出率为70.00%。耐药基因序列比对结果显示,所测菌株序列与数据库中相应耐药基因序列相似性均≥97%。     

离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平

环境中广泛存在的抗生素和抗生素抗性基因会导致很严重的人类健康风险。在我们前期研究中发现,离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])作为环境选择性压力可以促进抗生素抗性基因的水平转移。本研究以E.coli DH5α(RP4)和同属的E.coli HB101,以及E.coli DH5α(RP4)和跨属的Salmonella enterica之间的纯菌接合转移体系为考察对象,从mRNA基因表达调控水平角度阐明离子液体[BMIm][PF6](0.001~2.5 g·L-1)影响质粒RP4接合转移的机理。结果表明,离子液体[BMIm][PF6]通过抑制基因kor A,kor B和trb A的mRNA表达水平来提高接合和跨膜转运基因trb Bp和trf Ap的表达;增强水平转移基因tra F的mRNA表达水平,并通过增强负调控基因kil A和kil B的mRNA表达水平抑制质粒的垂直传递过程;通过抑制基因trb K的mRNA表达水平降低接合转移体系的排斥效果,从而促进质粒RP4的接合转移。该结果有助于为抗生素抗性基因在环境中水平转移扩散的机理研究提供理论依据。     

序言

<正>近几年,人类对抗生素的大量使用甚至是滥用造成抗生素的环境污染问题日益突显,抗生素及抗生素抗性基因作为全球新兴污染物在环境各介质中传播和扩散,即使抗生素在停止使用后,由其引发的抗性基因不会在短期内消除,并在不同细菌之间传播扩散,一旦传播至致病菌,将对人体健康构成很大威胁。由此,由抗生素滥用引起的抗生素污染以及抗性基因的潜在健康风险成为交叉研究领域包括地球化学、环境科学、分析     

抗生素抗性基因在环境中的来源、传播扩散及生态风险

近年来,由于抗生素的滥用首先诱导动物体内产生抗生素抗性基因(antib iotic resistance genes,ARGs),从而加速了抗性基因在环境中细菌间的传播扩散.目前,抗生素抗性基因作为一类新型环境污染物,在不同环境介质中的传播、扩散可能比抗生素本身的环境危害更大.本文针对抗生素抗性基因在地表水、地下水、医疗废水、城市污水处理厂、养殖场、土壤、沉积物以及大气环境中的来源、分布、传播情况以及国内外最新研究动态进行综述.分析了抗生素抗性基因在环境中的潜在传播途径及其可能影响因素,并指出光照,厌氧,高温处理可以有效遏制抗生素抗性基因在环境中的传播和扩散.揭示了抗生素抗性基因可能造成的生态风险,针对我国对该类污染物的研究现状,提出了今后的研究重点.