FDA-PI双色荧光法检测蓝藻细胞活性的研究

对FDA-PI双色荧光法检测水华鱼腥藻和铜绿微囊藻的活性进行了研究,用荧光显微镜对染色结果进行测定.结果表明,在蓝色光激发下(495nm),活细胞被双醋酸荧光素FDA染成亮绿色,死亡细胞被碘化丙锭PI染成红色.染色效率与原植体类型和细胞密度有关.对细胞密度为6×107—7×109个·l-1的铜绿微囊藻,FDA染色效率可达94%以上.对细胞密度为4×107—5×108个·l-1的水华鱼腥藻,FDA染色效率可达91%以上,但细胞密度增大到5×109个·l-1时,由于藻丝体易卷曲在一起,FDA染色率下降到67%.对死亡细胞,PI染色率基本都可达到100%.因此,用FDA-PI检测活细胞和死亡细胞混合的细胞悬液,可根据细胞所发出的不同荧光而判断细胞活性.     

不同氮浓度下三角褐指藻生长特性和化学组成

三角褐指藻是一类海洋单细胞硅藻,富含多不饱和脂肪酸,可以作为鱼、虾、贝等理想的饵料。而近年该藻曾多次在我国沿海海域发生暴发性增殖,给当地生态环境带来了一定的影响。为了探讨不同氮浓度对三角褐指藻生长特性和化学组成的影响,设置了低氮(44 μ mol.L-1)、中氮(880 μmol.L-1)和高氮(4 400 μmol.L-1)浓度三种处理,着重测定三角褐指藻的细胞密度、比生长率、生物量、可溶性糖、蛋白质含量和叶绿素含量等指标。结果表明,高氮浓度明显地促进了藻细胞的生长繁殖。高氮浓度下的藻细胞密度、比生长率和生物量分别比低氮浓度下的提高了 5.38 倍、0.81 倍和 2.86 倍。藻生长前期,高氮浓度和中氮浓度下的生长曲线相似,呈现一个"S"型的曲线。另外,高氮浓度下的藻细胞可溶性糖、蛋白质和叶绿素a含量分别是低氮浓度下的 2.5 倍、1.5 倍和 15 倍,说明高氮浓度促进了藻细胞化学组成的转化和积累。结果揭示,氮浓度可能是导致三角褐指藻近年在我国沿海海域发生暴发性增殖的重要因素。     

应用流式细胞技术研究铜对藻细胞膜完整性及脂酶活性的影响

应用流式细胞技术(FCM)及PI/FDA染色方法,在不同Cu2浓度处理后,从细胞膜完整性、脂酶活性两方面同时研究了Cu2 处理对微囊藻细胞的急性毒性作用.检测结果表明,在不同浓度Cu2 处理M.aeruginousa1h时,PI荧光检测显示藻细胞膜的完整性几乎没有受到影响,而FDA荧光检测则表明藻细胞的脂酶活性在一定浓度受到刺激.在Cu2 处理24h时,随着Cu2 浓度的增高,PI和FDA荧光强度变化的概率均呈明显的浓度抑制型变化,说明在此时Cu2 作用下FDA荧光的下降,不仅与细胞内脂酶活性受到抑制有关,而且也是高浓度Cu2 作用下细胞膜受损而导致细胞内含物外流的结果.图3参16     

染料木黄酮诱导人结肠癌SW480细胞凋亡及机制

目的探讨染料木黄酮(GEN)诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的生物学效应及抗肿瘤机制.方法通过MTT法检测GEN对该细胞系生长的影响;应用PI染色流式细胞术(FCM)分析GEN处理前后的细胞周期分布的变化;SP免疫组化法检测细胞内bcl-2、Bax蛋白的表达.结果GEN能抑制SW480细胞增殖,呈浓度依赖性.流式细胞仪示不同浓度GEN作用于SW480细胞,出现G2/M阻滞;SP免疫组化结果表明GEN处理细胞72 h后,Bax蛋白表达升高,bcl-2蛋白表达下降.结论GEN有诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的作用,其机制与bcl-2/Bax比值下降有关.图2,参12.     

橙盖鹅膏菌中过氧麦角甾醇对人卵巢癌A2780S细胞增殖的影响

为了解橙盖鹅膏菌中分离得到的过氧麦角甾醇对人卵巢癌A2780S细胞增殖的影响及其可能的机制,取对数生长期的A2780S细胞,经1.10、2.19、4.38、8.75、17.5、35μmol/d L等浓度下的过氧麦角甾醇作用,以CCK-8法测试24、48和72 h后细胞增殖;经2.19、4.38、8.75μmol/d L浓度的过氧麦角甾醇作用24 h后,倒置显微镜下观察细胞形态,DAPI染色法观察细胞核形态,Annexin V/PI双染流式细胞术测定细胞的早期凋亡率,PI单染流式细胞术测定细胞周期.结果显示,过氧麦角甾醇作用于人卵巢癌A2780S细胞后,17.5μmol/d L、35μmol/d L浓度组48 h、72 h出现大量细胞死亡,贴壁存活细胞数目明显减少,细胞核呈现核浓缩的高量区域及月牙状的特征,细胞早期凋亡率、细胞S期比例显著增加.本研究表明过氧麦角甾醇对A2780S细胞增殖具有明显抑制作用,可能与其阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关.     

全氟辛酸对斜生栅藻细胞膜特性影响研究(Effect of Perfluorooctane Acid on Cell Membrane Properties of Scenedesmus obliquus)

斜生栅藻暴露于全氟辛酸(PFOA)中,其细胞膜特性可通过不同荧光染料染色的荧光信号变化来反映.应用流式细胞仪检测荧光信号,研究了PFOA对斜生栅藻细胞膜的完整性、选择透过性和膜电位指标的影响效应.实验结果显示,全氟辛酸对表征细胞膜完整性的碘化丙啶(PI)染料荧光强度起到显著刺激作用,栅藻细胞膜受损几率随暴露浓度升高呈现上升趋势;低暴露浓度下栅藻细胞膜选择透过性增强,但在高浓度暴露下这一细胞膜特性受到明显抑制,具体表现为表征酯酶活性的二乙酸荧光素(FDA)荧光强度出现先升后降的变化;与FDA荧光强度变化趋势相反,反映膜电位的碘代3,3’-二己氧基羰花青(DIOC6(3))荧光强度则先降后升,预示高浓度PFOA暴露将导致细胞膜处于异常的生理状态.     

天然提取物抗PM2.5诱导A549细胞凋亡的作用

采集北京城区大气可吸人颗粒物中的细颗粒物(PM25),用其对人肺腺癌A549细胞染毒,探讨PM25对细胞增殖的毒性和诱导细胞凋亡的作用,并且考察了加入不同浓度的红豆越橘提取物和竹叶提取物对其的抗性作用.实验采用MTT法检测细胞增殖作用,采用Annexi V-FITC/PI双染法和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果显示:PM2...     

铁浓度诱导的三角褐指藻生长和生化组分变化

采用试验生态学方法,以海洋硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)为研究材料,设置一系列铁浓度处理(3.15mg·L-1、6.30 mg·L-1、9.45 mg·L-1、18.90 mg·L-1和34.65 mg·L-1),着重测定藻液光密度(OD450)、比生长率、藻细胞密度、藻生物量、叶绿素含量和蛋白质含量等生理生化指标,探讨铁浓度对海洋微藻生长特性和生化组分的影响.结果表明,铁浓度对三角褐指藻的生长状况产生了显著的影响.三角褐指藻经培养48 h后,不同铁浓度下的藻液光密度(OD450)存在显著的差异,6.30 mg·L-1铁浓度下的藻液光密度值(OD450)最高,而随着铁浓度的进一步升高,藻液光密度值(OD450)却明显降低;比生长率和藻细胞密度在3.15 mg·L-1到9.45 mg·L-1铁浓度范围内随着铁浓度升高而增大(最大值分别约为0.609 d-1和1200×104 cell·mL-1),但高于9.45 mg·L-1的铁浓度显著降低了比生长率和藻细胞密度;在试验所设置的铁浓度范围内,藻生物最表现出随铁浓度的升高而增大的趋势,34.65 mg·L-1铁浓度下的藻生物量高达0.460 mg·ML-1.同样地,微藻叶绿素a含量和蛋白质含量也明显地受到铁浓度的影响.在3.15 mg·L-1到18.90 mg·L-1铁浓度范围内,叶绿素a含量逐渐增高(最大值为2.41 mg·L-1);同样地,蛋白质含量在9.45 mg·L-1.铁浓度下达到最大值(0.153 mg·mL-1),而随着铁浓度的逐渐升高,叶绿素和蛋白质含量却明显降低.研究结果表明.铁浓度诱导海洋微藻的生长及代谢发生变化.一定较高浓度的铁显著地促进了藻细胞的生长繁殖和藻细胞化学组分的转化和积累.这些发现将有利于加深认识铁浓度在海洋生态系统中扮演的角色,进一步明确赤潮爆发的生理生态机制,从而有助于人们采取有效的预测、预防和管理措施以降低赤潮的危害.     

甲醛诱导Hela细胞凋亡的研究

细胞凋亡是当今环境毒理学领域的研究热点之一.为了探讨甲醛能否诱导细胞凋亡,以Hela细胞为实验材料,通过不同浓度的甲醛处理24h后,应用形态学观察、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和流式细胞仪检测了Hela细胞凋亡情况.实验结果表明低浓度甲醛(≤0.2mmol·L-1)处理Hela细胞24h后,对细胞生长有显著的抑制作用(p<0.05),但对细胞形态改变不大,且对细胞核DNA没有损伤;而高浓度甲醛(≥0.4mmol·L-1)处理Hela细胞24h后,对细胞生长有极显著的抑制作用(p<0.01),细胞形态逐渐变的模糊不清,并有少量细胞萎缩成圆形,且会造成细胞核DNA有规律的断裂,细胞凋亡率随甲醛浓度的增加而增大.以上实验结果显示,高浓度甲醛处理Hela细胞24h后,会诱导细胞凋亡;并且随甲醛浓度的升高凋亡率逐渐增大,呈一定的剂量-效应关系.     

流式细胞术在铜对藻类生态毒理研究中的应用

用流式细胞术研究了铜对铜绿微囊藻的毒性作用 ,结果表明 ,一定浓度的铜对藻类的生长具有抑制作用 ,而且这种抑制作用随着铜浓度的增加而增加 ,96h的EC50 为 82 86μg·l- 1 ,当铜浓度为 1 0 1 2 5 μg·l- 1 时 ,藻细胞的生长几乎完全受到抑制 .流式细胞仪检测结果可以说明铜对藻类群体作用的过程 ,即铜并不是同时对所有的藻细胞产生抑制作用 .低浓度时只是对部分细胞产生抑制 ,随着铜浓度的升高 ,受到抑制的细胞也越多 ,当达到最高浓度时 ,几乎所有细胞的生长都受到抑制 .     

邻苯二甲酸二丁酯对海洋微藻生长的影响

近年来,内陆和近海水体中的一种典型环境激素邻苯二甲酸二丁酯(DBP)含量显著上升,但其对海洋生态系统的影响并不明确。本研究选取7种海洋微藻为实验材料,包括1种甲藻(东海原甲藻Prorocentrum donghaiense),2种定鞭藻(小普林藻Prymesium parvum和球形棕囊藻Phaeocystis globosa),2种硅藻(中肋骨条藻Skeletonema costatum和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum),以及1种隐藻(红胞藻Rhodomonus salina)和1种绿藻(海洋小球藻Chlorella sp.),设置5个DBP暴露浓度(5、10、20、50、100μg·L-1),研究其对海洋微藻生长的影响,并探索DBP暴露对微藻抗氧化系统和光合系统的影响。结果表明:在所有暴露组中,球形棕囊藻、小普林藻、东海原甲藻、红胞藻、海洋小球藻生长速率显著增加;5~20μg·L-1的DBP暴露下中肋骨条藻不受影响,50、100μg·L-1下受到抑制;所有DBP暴露组对三角褐指藻没有显著影响。在50μg·L-1DBP暴露下,随着时间的延长,球形棕囊藻的SOD、CAT、MDA均表现出先升高后下降的趋势,第7天藻的叶绿素a、叶绿素b,类胡萝卜素含量较对照组分别增加了23%、10%、48%,球形棕囊藻光系统II(PSII)的最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSII的潜在活性(Fv/F0)、光合性能指数PI分别增加了4.8%、16%、69%。研究发现DBP对海洋微藻的影响具有种间差异性,能够显著促进有害赤潮藻球形棕囊藻的生长,近岸水体DBP含量的增加可能改变浮游植物群落组成,进而增加有害藻华暴发的风险。     

流式细胞计分析海洋微微型浮游生物:样品固定及贮存方法

以流式细胞计为海洋微微型浮游生物的分析工具,研究了醛类固定剂的固定、液氮贮存对于微微型浮游生物的细胞大小、密度、藻红素荧光值(FL2)和叶绿素荧光值(FL3)的影响.实验主要结论为1)液氮环境适于贮存固定的微微型浮游生物样品,而未固定样品在液氮中贮存后细胞密度有损失;2)醛类固定剂对微微型浮游生物样品的细胞密度基本没有影响;3)醛类固定剂可增强微微型浮游生物的荧光强度,其中戊二醛主要影响聚球藻的FL2强度,多聚甲醛主要影响FL3强度.认为多聚甲醛是适用于微微型浮游生物的固定剂,推荐使用浓度为0.8%~1.2%,此外戊二醛浓度为0.05%、多聚甲醛浓度为0.8%~1.2%的混合固定剂亦适用于固定微微型浮游生物.图4参15     

Vero细胞对2,4,6-三氯苯酚的毒性响应特征和敏感性分析

以2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-trichlorophenol,TCP)为例,采用MTT比色实验和ANNEXIN V-FITC/PI双染色-流式细胞技术研究了Vero细胞对有机化学污染物的毒性响应特征和敏感性,以期发现一种灵敏、可靠的表征微量化学物质综合毒性的方法.研究结果表明:1)TCP浓度对Vero细胞的毒性响应特征有决定作用.低浓度TCP(≤0.5mg·L-1)即可使部分细胞从原有的刚性不规则三角形结构变为圆形或椭圆形,但细胞的生长未受明显抑制.TCP浓度在1~5mg·L-1时,细胞生长开始受到抑制,表现为细胞增殖受到抑制及部分细胞凋亡或死亡,但增殖抑制率和TCP浓度之间的关系不明显.当TCP浓度大于5mg·L-1时,细胞增殖明显受到抑制,且随TCP浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐升高.2)TCP作用时间对Vero细胞的毒性响应特征有显著影响.ANNEXIN V-FITC/PI双染色-流式细胞仪检测结果表明,TCP作用24h内Vero细胞毒性表现为以细胞膜的完整性受到损伤为主,凋亡或坏死细胞比例较小;而48h后,凋亡细胞的比例明显增加.细胞复壮实验结果进一步证实24h内形态发生变化的细胞并未完全坏死或凋亡.以上结果表明细胞形态变化和细胞膜损伤均为细胞毒性的早期表现特征,两者之间可能存在某种相关性,以此表征化学污染物的生物毒性具有较高的灵敏度,值得进一步研究.     

海洋微藻活体及乙醇固定状态下基因组DNA的微量提取方法

探讨了海洋微藻活体及固定状态下基因组DNA的提取方法,即作者改进的CTAB法.结果表明,CTAB改进法提取的基因组DNA蛋白质、酚、盐和小分子的污染较少,多糖成份也得到了有效去除.用5%乙醇固定样本提取DNA的效果最好,对原生动物抑制效果也较明显;10%以上的乙醇可杀死原生动物,但对DNA的降解率较大;30%以上的乙醇对细菌抑制较明显,但DNA都有较大程度的降解.本法提取的DNA可用于正常的酶切和PCR.用甲醛、甲醇/冰醋酸等其它固定液固定样品,DNA的得率低或者质量和纯度低.图7表1参27     

比较两种RAD54启动子调控的全酵母发光细胞对化学诱变原的评价效果

通过分子生物学技术构建2种不同RAD54启动子调控的yEGFP重组报告载体p RAD54-yEGFP和p RAD54S-yEGFP,前者启动子DNA为1.8 kb,后者为0.5 kb,分别转入W303-1A酵母细胞,构建2种启动子调控的发光酵母细胞,用不同化学诱变原作用后,用流式细胞仪和多功能发光仪测定酵母的发光强度。结果发现2种启动子调控的酵母细胞的发光强度均与化学诱变原(甲磺酸甲脂、4-硝基-N-氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明显的剂量效应关系,但是W303-1A/RAD54-yEGFP剂量效应关系较为明显,产生的最大诱导倍数(5.96、2.19和2.71)明显高于W303-1A/RAD54S-yEGFP所产生的最大诱导倍数(2.53、1.50和1.91),可能与启动子序列中转录因子的数量以及转录因子间协同增效作用有关。同时发现,流式细胞仪测定效果明显优于发光仪测定效果。所以在构建RAD54启动子调控重组酵母细胞筛选诱变时,选用全启动子序列效果较好。     

比较2种RAD54启动子调控的全酵母发光细胞对化学诱变原的评价效果

通过分子生物学技术构建2种不同RAD54启动子调控的yEGFP重组报告载体pRAD54￣yEGFP和pRAD54S￣yEGFP,前者启动子DNA为1.8 kb,后者为0.5 kb,分别转入W303￣1A酵母细胞,构建2种启动子调控的发光酵母细胞,用不同化学诱变原作用后,用流式细胞仪和多功能发光仪测定酵母的发光强度。结果发现2种启动子调控的酵母细胞的发光强度均与化学诱变原(甲磺酸甲脂、4￣硝基￣N￣氧化喹啉和5￣氟尿嘧啶)有明显的剂量效应关系,但是W303￣1A/RAD54￣yEGFP剂量效应关系较为明显,产生的最大诱导倍数(5.96、2.19和2.71)明显高于W303￣1A/RAD54S￣yEGFP所产生的最大诱导倍数(2.53、1.50和1.91),可能与启动子序列中转录因子的数量以及转录因子间协同增效作用有关。同时发现,流式细胞仪测定效果明显优于发光仪测定效果。所以在构建RAD54启动子调控重组酵母细胞筛选诱变时,选用全启动子序列效果较好。     

大气细颗粒物PM2.5对大鼠睾丸组织细胞周期的影响

为了研究大气细颗粒物(PM2.5)对雄性大鼠的生殖毒性作用,将不同剂量的PM2.5颗粒物悬液采用气管滴注方式对雄性Wistar大鼠分组染毒,染毒剂量分别为0、1.6、8.0、40.0mg·kg-(1BW),24h后应用流式细胞术对睾丸组织细胞周期及DNA倍体进行检测分析.结果显示:PM2.5对大鼠睾丸组织各倍体细胞比例和细胞周期有明显影响,可导致二倍体细胞数显著降低(p<0.05);可引起以二倍体细胞为主的G0/G1期细胞比例显著下降(p<0.05),G2/M期细胞比例和细胞增殖指数(PI)显著上升(p<0.05).结果提示,PM2.5可透过血睾屏障,干扰细胞周期进程,对生殖系统具有一定的毒性作用.     

荇菜(Nymphoides peltatum)对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长的抑制效应及其机制

构建了荇菜(Nymphoides peltatum)与以铜绿微囊藻为优势种的自然藻体共培养系统,分析系统中各藻种藻细胞密度、藻体叶绿素a含量、荇菜生长指标及水下[光]照度的变化;同时以荇菜种植水配置培养基,在适宜光照条件下培养铜绿微囊藻,分析藻类生长生理指标随时间的变化.结果表明:共培养系统中藻类总藻细胞密度显著下降(P<0.05),其中铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)藻细胞密度下降最为明显,40 d时比初始藻细胞密度减少了94.68%,而三角四角藻(Tetraedron minimum)数量逐渐增多,成为优势藻种,表明荇菜对铜绿微囊藻生长具有明显抑制作用.共培养系统中荇菜鲜重、水下20 cm深处光衰减率均与藻类叶绿素a含量呈显著负相关(P<0.05),表明藻细胞光合能力的大小与荇菜植株的生长及其产生的遮光作用密切相关.随培养时间延长,添加荇菜种植水的培养基中铜绿微囊藻藻细胞光密度值(D650)下降明显;叶绿素a、藻胆蛋白(包括藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白)相对含量均有不同程度的下降,培养9 d后4者相对含量分别降至5.27%、15.53%、21.11%和48.48%;藻细胞Ca2+Mg2+-ATP酶活性下降明显,表明荇菜种植水中存在着某种对铜绿微囊藻产生抑制作用的活性物质,通过对铜绿微囊藻光反应系统(PS Ⅰ和PS Ⅱ)的作用来阻碍藻细胞光合作用进程,抑制藻类生长,说明除了遮光效应外,分泌抑藻活性物质也是荇菜抑制铜绿微囊藻生长的重要机制.     

茚虫威对斑马鱼的急性毒性及遗传毒性

茚虫威属噁二嗪类新型广谱高效杀虫剂,在农业生产中有着重要作用,近年来随着用量的增加,由此产生的对水生生物的影响越来越受到重视。使用斑马鱼进行茚虫威的急性毒性作用实验,并采用微核试验、彗星试验、Annexin V-FITC/PI双染色检测观察染毒后的斑马鱼是否被诱导产生遗传毒性。结果表明:在24 h、48 h、72 h、96 h,茚虫威LC50值分别为2.263mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.133 mg·L-1。茚虫威对斑马鱼急性毒性属中等毒性。96 h茚虫威浓度为1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1时,斑马鱼的微核率与对照组相比达差异极显著水平(P0.01)。采用彗星试验检测斑马鱼肝脏DNA损伤,结果显示斑马鱼暴露于高浓度1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1茚虫威后,与对照组相比,斑马鱼的DNA损伤均表现为极显著差异(P0.01)。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪法检测,结果表明染毒后24 h斑马鱼肝细胞出现细胞凋亡现象。实验结果进一步表明,茚虫威对斑马鱼短期染毒后诱导细胞凋亡,表现出遗传毒性。     

除菌处理对强壮前沟藻和青岛大扁藻空长的影响

对微藻除菌以及未除菌与除菌后微藻生长特性的变化进行了研究.采用抗生素(新霉素、链霉素和卡纳霉素)组合加入的方法,对微藻(强壮前沟藻和青岛大扁藻)进行了无菌化处理.通过吖啶橙染色,镜检观察到与藻细胞共生的细菌经抗生素处理后数最明显减少,从而成功获得了2种无菌海洋微藻的纯藻种.比较了抗生素除菌前后环境细菌对微藻生长的影响,结果表明,除菌后的强壮前沟藻与未除菌的相比,推迟2 d进入稳定期,处于稳定期的最大细胞密度比未除菌的提高了24%.除菌后的强壮前沟藻和青岛大扁藻不易老化,可保持良好的悬浮状态.图7表1参16