鹤望兰基因组DNA的提取方法

由于鹤望兰组织内含有大量多糖类及多酚类物质，严重干预DNA的抽提，利用常规的SDS法，CTAB法和高盐低pH值法都难以抽提出高质量的鹤望兰基因组DNA，本文报道了在进行若干预处理之后，再用常规的SDS，CTAB，SDS裂解的高盐低pH值法和CTAB裂解的高盐低pH值法提取基因组DNA的改进方法，根据外观，琼脂糖凝胶电泳检测，D260nm/D280nm比值的测定。限制性酶切反应，PCR扩增的结果表明，用改进方法提取的基因组DNA无论在纯度上还是在完整性上都比常规方法要好，其中改进SDS裂解的高盐低pH值法是提取鹤望兰基因组DNAS的最好方法。     

适用于流式细胞术的三角褐指藻核DNA染色方法

为制备可用于配置有488 nm激发器的流式细胞仪检测核DNA含量的三角褐指藻细胞,取对数生长期的三角褐指藻细胞,分别采用70%乙醇、1%戊二醛、1%甲醛溶液进行细胞固定,经RNase A消化后的样品用碘化丙啶(PI)染色,用SYBR-green I对未经RNase A消化的细胞染色,在荧光显微镜下观察细胞染色情况,用流式细胞仪检测细胞核DNA含量.结果显示:在荧光显微镜下观察到,3种不同固定液固定的细胞均表现为SYBR-green I只对藻细胞核染色,PI对于藻的细胞核与细胞质均有着色.流式结果的DNA直方图显示,SYBR-green I染色的细胞的DNA直方图有明显的G1与G2/M峰,拟合度(RCS)在3左右,变异系数(CV)在8.6%左右.而PI染色细胞的DNA直方图表现为变异系数值偏大,拟合度较低,没有明显的G1与G2/M峰.本研究表明,SYBR-green I是一种无需对细胞进行RNase A处理,可应用于配置有488 nm激光器流式细胞仪的核酸染料,可为研究在整个细胞周期的调控机制奠定基础,同时也为其他浮游植物细胞核的染色提供参考.     

几种含水介质中过硫酸钠去除苯系物/乙醇的效果和影响

为探究含水介质中过硫酸钠去除乙醇汽油主要组分苯系物(苯、甲苯、乙苯和二甲苯简称BTEX)和乙醇的效果,选用石灰土、玄武岩风化土、花岗岩风化土、白云石、河砂等5种不同特性的介质,在室温下开展批实验研究.结果表明,在自然条件下,乙醇的降解速率由大到小顺序为玄武岩风化土石灰土河砂花岗岩风化土白云石,乙醇容易被微生物降解且会阻碍BTEX的微生物降解;在单纯的化学氧化条件(灭菌)下,BTEX比乙醇更容易被过硫酸钠氧化去除.其中,石灰土和玄武岩风化土BTEX去除率分别为94.2%和97.6%,乙醇去除率分别为16.9%和37.0%;河砂、花岗岩风化土及白云石BTEX的去除率均大于99%,乙醇去除率在67.4%—73.6%之间.在未灭菌条件下,过硫酸钠化学氧化显著抑制玄武岩风化、花岗岩风化土、河砂中固有的微生物作用,但对石灰土介质的影响较小.介质固有的有机质以及过硫酸钠引起的pH降低,都会影响过硫酸钠对污染物的去除,而介质中铁氧化物的作用需要进一步评价.     

蚯蚓体腔细胞彗星试验检测阿散酸在泥浆体系中降解前后的遗传毒性变化

配制不同浓度的阿散酸标准液,与某养猪场附近的表层土壤混合形成泥浆系统,放在摇床上连续培养30d.在第0、1、2、3、4周取出适量降解液,分别用分光光度法测定阿散酸的降解率;用彗星试验检测降解液对赤子爱胜蚓体腔细胞DNA的损伤.结果表明,阿散酸低浓度时在泥浆体系中能被较快降解,500mg/L的降解率达到了25%;蚯蚓体腔细胞彗星试验表明,所有降解液均具有遗传毒性,可导致蚯蚓体腔细胞DNA明显损伤,与对照相比具有显著性差异(P<0.05).图1表1参17     

杨树人工林连作与轮作土壤酚酸降解细菌群落特征及酚酸降解代谢规律

杨树人工林的连作障碍与土壤中的酚酸累积有密切关系.采用宏基因组测序技术研究I-107(Populus×euramericanna‘Neva’)欧美杨人工林连作与轮作土壤酚酸降解细菌群落特征及酚酸降解代谢的演变规律.供试土壤中共发现5种酚酸降解细菌,分别是假单胞菌(Pseudomonas sp.)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)、Acetobacteraceae bacterium AT-5844、多噬伯克霍尔德菌(Burkholderia multivorans).土壤酚酸降解细菌的丰度因人工林主伐更新轮作方式而异(P0.05),表现为Ⅰ代林地轮荒地轮作花生地Ⅱ代林地.杨树Ⅰ代林和Ⅱ代林土壤酚酸降解细菌的群落结构基本一致,总丰度Ⅱ代林较Ⅰ代林减少了9.69%,根际土壤中皮氏罗尔斯顿菌和Acetobacteraceae bacterium AT-5844丰度明显高于非根际土壤,根际效应明显;与杨树Ⅱ代林地相比,轮作花生地和轮荒地土壤中酚酸降解细菌总丰度分别增加了1.74%和8.27%.供试土壤中共发现6种酚酸降解关键酶,不同土壤中酚酸降解酶基因表达丰度存在显著差异(P0.05),总体表现为Ⅰ代林地Ⅱ代林地轮作花生地轮荒地,杨树Ⅱ代林地比Ⅰ代林地低11.18%,而轮作花生地和轮荒地分别又比杨树Ⅱ代林地低27.62%和19.90%,但轮作花生地和轮荒地中酚酸脱羧酶的基因表达丰度较杨树Ⅱ代林分别增加了73.33%和33.33%.因此,杨树人工林连作一代后,土壤中酚酸降解细菌的生长和代谢活性均受到了抑制;轮作可以改善连作对杨树人工林部分土壤酚酸降解细菌生长繁殖和代谢活动的影响.     

油松种子醇溶蛋白提取剂比较

采用乙醇、尿素、2氯乙醇、2巯基乙醇等配成的不同浓度和成分的提取剂提取了山西太岳龙门口、陕西洛南、辽宁千山和河北雾灵山4个不同油松种群的种子醇溶蛋白;用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(APAGE)对蛋白提取液进行分析.条带数目反映所提取醇溶蛋白的数量,谱带颜色深浅反映不同提取剂得到的某种醇溶蛋白的量.结果表明,不同提取剂提取的醇溶蛋白图谱存在明显差异.由1%2巯基乙醇和12%尿素组成的复合提取剂提取效果最佳,其次是由20%2氯乙醇、1%2巯基乙醇和12%尿素组成的复合提取剂.提取的醇溶蛋白的电泳图谱可以用于油松种群的遗传多样性分析和系统演化的研究.图1表2参11     

Fenton法与光Fenton法降解2,4-D的研究

对Fenton法与光Fenton法降解农药2,4-D进行了研究.探索了反应条件对降解效果的影响;确定了反应动力学和处理效率;同时考察了主要阴离子对反应效率的影响;以及不同条件下体系中羟自由基(·OH)的产生规律.结果表明,过氧化氢或亚铁离子的浓度过低或过高都对2,4-D的降解有不利影响,氧化剂与催化剂之间的最佳比例为5:1,最佳初始pH值在3.0-3.5之间.在最佳条件下,氧化剂与2,4-D比例为1:1时,可在10min内降解85%的农药,TOC去除率也达80%以上.引入紫外线,可在降低氧化剂剂量下达到同样效果.碳酸根和磷酸根分别在不同程度上影响2,4-D的降解效率.各种条件对体系中·OH产生效率的影响与2,4-D降解效果的变化规律一致,说明·OH是导致2,4-D降解的活性基团.     

废水中十六烷基三甲基溴化铵的光降解动力学研究

季铵盐类阳离子表面活性剂污染会对水生环境产生不利影响,研究了在紫外灯下以Fe3+为单一催化剂降解水体中阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的降解动力学规律.实验通过测定光降解过程中CTAB质量浓度的变化,研究了Fe3+质量浓度、溶液pH对CTAB降解的影响.初步测定了降解产物,探讨了降解机理.结果表明,CTAB光降解反应符合一级反应动力学规律,在溶液pH值为2.00～3.00时,一级动力学反应常数k受pH值、Fe3+质量浓度等影响,在0.032～0.180min-1之间变化,降解产物主要有HCOOH、CO2、NO-2等,当CTAB初始质量浓度为40 mg·L-1时TOC去除率在3 h达到32%.研究表明UV/Fe3+法可快速有效去除废水中季铵盐类表面活性剂污染物.     

瓜蒌叶黄酮的提取工艺优化及其生物活性研究

对瓜蒌叶黄酮进行生物活性初步研究,探究瓜蒌叶作为天然食品添加剂的价值.在单因素试验和正交试验的基础上,结合极差分析法,得出水浴加热的条件下以乙醇为提取溶剂的最佳提取方法(固液比1∶60、提取时间2 h、提取温度70℃、乙醇质量分数60%);再在此条件下提取瓜蒌叶黄酮进行DPPH自由基清除试验,测定瓜蒌叶黄酮的抗氧化能力;再以大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌作为试验对象进行抑菌试验,初步测定瓜蒌叶黄酮的抑菌能力.试验结果表明瓜蒌叶黄酮具有良好的抗氧化能力,但是在低浓度时抑菌效果并不明显,在提高浓度后或许会有不错的抑制效果.     

镉铜污染尾矿土中添加耐镉铜菌剂J5后微生物区系多样性的变化

采用酶解法和化学裂解法相结合的方法从安徽铜陵镉铜污染尾矿土中提取出土壤微生物基因组总DNA,并应用PCR-DGGE技术对比研究尾矿土中添加外源硫酸镉、硫酸铜和耐镉铜菌剂J5(Pseudomonassp.)后微生物区系多样性的变化.结果表明,尾矿土中微生物基因组总DNA分子量大小为21kb左右,未复垦的尾矿砂中微生物总DNA量较少,CdSO4处理后的尾矿土中微生物基因组总DNA量明显下降,而添加菌剂J5的尾矿土中微生物基因组总DNA量上升.DGGE电泳图谱进一步显示,尾矿土样中添加镉离子使图谱条带减少,分析表明尾矿土中的细菌种类数减少;而添加菌剂J5使图谱中条带明显增加,表明菌剂J5可提高尾矿土中土著微生物的活性和群落丰富度,可用于复合重金属污染尾矿区的生态恢复.     

快速提取用于PCR分析的几种蔬菜DNA的方法

利用两种不同的简便方法提取大白菜、大葱和厚皮酣瓜发芽种子的DNA,均能产生具有重现性的RAPD结果这两种方法提取DNA的PCR扩增结果与多次利用苯酚／氯仿提取DNA的结果一致.RNase处理与否对提取DNA的PCR扩增结果没有影响.方法1不用氯仿,但残留蛋白质等容易造成DNA溶解困难;方法2提取的DNA纯度高对于含蛋白质较少的植物器官或组织,可以选用方法1,而对于含蛋白质较多的植物器官或组织,宜选用方法2.两种方法提取的DNA量与用苯酚／氯仿提取DNA的量相似样品之间提取DNA量的多少主要受研磨破碎程度高低所决定.方法1每人每天提取约120个样品,方法2提取约100个样品,比先前的方法快1倍多.所提取的每个样品DNA约能用于100次PCR反应,两种DNA提取方法简便、迅速,为快速进行大量样品的PCR分析提供了条件.     

Pacific harbor seals (<Emphasis Type="Italic">Phoca vitulina</Emphasis>) and salmon: genetics presents hard numbers for elucidating predator-prey dynamics

We used a PCR-based species test and microsatellite genotyping to determine salmonid species composition and quantity of Chinook among Pacific harbor seal (Phoca vitulina) prey. Tests were applied to DNA extracted from all salmonid bones recovered from scat (fecal) samples. Condition of bone samples and quantity of DNA varied substantially. Although DNA extraction and species identification was only successful for just over half of the bone samples, 93% of all scat samples had bones that were identified to species. Most often only a single salmonid prey species was evident within a scat sample (39% exclusively coho and 46% exclusively Chinook) but 13% contained bones from more than one species of salmonid. For scat samples that contained Chinook bones, 68% had skeletal remains from the same fish and 32% had bones from more than one individual Chinook, varying in number from two to four individuals per scat. In one case, bones from one individual Chinook were recovered in three different scat samples.     

土壤中不同老化时间的DDT对小麦根系的生物有效性

研究了水、正己烷、正己烷/丙酮ASE对土壤中不同老化时间的DDT的逐级提取量的差别及其与小麦根吸收的关系。结果表明,有机氯的水提量随老化时间增加而下降,正己烷提取量随老化时间增加而下降,正己烷/丙酮提取量随老化时间增加而上升。植物根吸收随老化时间增加而下降。根吸收与水提量没有确定关系,与正己烷提取量具正相关关系,与正己烷/丙酮提取量有负相关关系。正己烷提取量可被作为土壤有机氯DDT的有效态部分。     

水稻中氟虫双酰胺及其代谢产物的超高效液相色谱残留分析方法

采用超高效液相色谱法分析了氟虫双酰胺及其代谢产物在田水、土壤、稻秆、糙米和稻壳中的残留.水样以乙酸乙酯为萃取溶剂,液-液分配净化;土壤样品以丙酮为提取剂,液-液分配净化;水稻样品经乙腈提取,NH2-Carb柱净化.对水稻和环境中的氟虫双酰胺及其代谢产物进行不同水平的添加回收率实验,方法的回收率在78.2%—104.8%之间,相对标准偏差为1.1%—4.4%.氟虫双酰胺及其代谢产物的最小检出量在0.004—0.02 ng,其在稻田水中的最低检测浓度为0.0008—0.0009 mg.L-1,在土壤、稻秆、糙米、稻壳中的最低检测浓度为0.001—0.003 mg.kg-1.     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

Solvent effects on quantitative analysis of brominated flame retardants with Soxhlet extraction

Reliable quantifications of brominated flame retardants (BFRs) not only ensure compliance with laws and regulations on the use of BFRs in commercial products, but also is key for accurate risk assessments of BFRs. Acetone is a common solvent widely used in the analytical procedure of BFRs, but our recent study found that acetone can react with some BFRs. It is highly likely that such reactions can negatively affect the quantifications of BFRs in environmental samples. In this study, the effects of acetone on the extraction yields of three representative BFRs [i.e., decabrominated diphenyl ether (decaBDE), hexabromocyclododecane (HBCD) and tetrabromobisphenol A (TBBPA)] were evaluated in the Soxhlet extraction (SE) system. The results showed that acetone-based SE procedure had no measureable effect for the recovery efficiencies of decaBDE but could substantially lower the extraction yields for both TBBPA and HBCD. After 24 h of extraction, the recovery efficiencies of TBBPA and HBCD by SE were 93 and 78% with acetone, 47 and 70% with 3:1 acetone:n-hexane, and 82 and 94% with 1:1 acetone:n-hexane, respectively. After 72 h of extraction, the extraction efficiencies of TBBPA and HBCD decreased to 68 and 55% with acetone, 0 and 5% with 3:1 acetone/n-hexane mixtures, and 0 and 13% with 1:1 acetone/n-hexane mixtures, respectively. The study suggested that the use of acetone alone or acetone-based mixtures should be restricted in the quantitative analysis of HBCD and TBBPA. We further evaluated nine alternative solvents for the extraction of the three BFRs. The result showed that diethyl ether might be reactive with HBCD and may not be considered as the alternative to acetone used solvents for the extraction of HBCD.     

质粒DNA小量提取法的改进

介绍了一种改进的小量提取质粒DNA的方法,该方法用NH4Ac和LiCl代替常规方法中苯酚和氯仿的抽提,有效去除了样品中RNA和蛋白质;用95%乙醇代替无水乙醇沉淀质粒DNA,降低了终产物中盐和多糖等杂质的含量,获得的质粒DNA质量好,产率高,能满足常规分子生物学实验的要求,如PCR、酶切、转化大肠杆菌以及植物遗传转化.图4表1参7     

Modified pretreatment method for total microbial DNA extraction from contaminated river sediment

Extraction of high-quality microbial DNA from contaminated environmental samples is an essential step in microbial ecological study. Based on previously published methods for soil and sediment samples, a modified pretreatment method was developed for extracting microbial DNA from heavily contaminated river sediment samples via selection of optimal pretreatment parameters (i.e., reagent solution, reaction duration, and temperature). The pretreatment procedure involves washing the river sediment sample for three times with a solution containing 0.1 mol·L^-1 ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 0.1 mol·L^-1 Tris (pH 8.0), 1.5 mol·L^-1 NaCl, 0.1 mol·L^-1 NaH₂PO₄, and Na₂HPO₄ at 65°C with 180 r·min^-1 for 15 min to remove humic materials and heavy metals prior to the employment of standard DNA extraction procedures. We compared the results of standard procedure DNA extraction following pretreatment, without pretreatment, and with using a commercial PowerSoil^TM DNA Isolation Kit. The results indicated that the pretreatment significantly improved the DNA quality based on DNA yield, DNA fragment length, and determination of prokaryotic diversity. Prokaryotic diversity exhibited in the DNA with the pretreatment was also considerably higher than that extracted with the PowerSoil^TM DNA Isolation Kit only. The pretreatment method worked well even with a small amount of sediment sample (0.25 g or even lower). The method provides a novel, simple, cost-effective tool for DNA extraction for microbial community analysis in environmental monitoring and remediation processes.     

西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

底泥水体中适用于PCR的不同形态DNA的提取方法（Methods of Extraction Different Gene Types of Sediments and Water for PCR Amplification）

提出直接从环境河流底泥和表层水体中同时提取不同形态DNA(胞内、胞外、染色体和质粒DNA)的有效方法.利用该方法提取了海河典型区域底泥的胞外DNA和胞内DNA及水体中细菌染色体DNA和质粒DNA.结果表明,NaH2PO4提取的胞外DNA分子量大于1kb,提取率40%～72%,没有共提取胞内DNA.胞内DNA提取的分子量均大于23.1kb,细菌质粒DNA与染色体DNA同时分离.16SrDNA与sul2扩增验证提取方法可靠性.16SrDNA扩增结果显示所有胞外DNA呈阴性,胞内DNA呈阳性.质粒DNA和染色体DNA的16SrDNA扩增显示,染色体DNA结果显阳性,质粒DNA呈阴性,sul2的结果相反.