受体报告基因实验及其在维甲酸和维甲酸X受体干扰物监测中的应用

受体报告基因实验具有快速、经济、灵敏、方便等诸多优势,在高通量筛选类或抗雌雄激素等通过核受体起作用的环境内分泌干扰物方面得到了广泛的应用。环境中的维甲酸和维甲酸X受体干扰物如有机锡等有着类似的作用机制,研究者也开始采用受体报告基因实验的方法对该类污染物进行筛选与监测。本文综述了受体报告基因实验的技术方法,包括报告基因和宿主细胞的选择,并介绍了该方法在人工合成的维甲酸和维甲酸X受体干扰物筛选以及环境样品中该类污染监测中的应用。综述总结了应用受体报告基因实验检测环境内分泌干扰物研究中的不足并对该方法的未来发展进行了展望,希望为该方法在环境监测和评估中的应用提供新的思路。     

基于高灵敏度全细胞传感器的汞转化基因元件评价体系

汞是最具毒性的重金属之一;不同形态的汞具有的毒性差异大,发掘高效的不同汞形态转化的基因元件,通过合成生物学手段构建汞的微生物转化减毒体系是未来汞污染治理的重要方向;因此,发展和建立一套基因元件功能和效率的评价体系,是筛选高效汞形态转化基因的关键.基于MerR这一汞离子特异性响应蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因所构建的汞离子大肠杆菌细胞传感器,首先通过引入汞转运蛋白MerT提高汞离子的响应程度,构建含pUC57-MerT-MerR-GFP的细胞传感器.该传感器4h对氯化汞(HgCl₂)的响应浓度为5-200μg/L,响应能力与汞离子浓度线性相关.在此基础上,将含有待测试汞转化基因的pACYC184质粒转入这一传感器,构建含相容性双质粒的大肠杆菌体系,通过GFP荧光的强度(胞内汞离子浓度)来评价待测基因是否具有将汞离子转化成其他形态的功能及其效率.抗生素处理下,相容性双质粒在大肠杆菌中拷贝数保持稳定,可用于基因元件评价.通过生物信息学分析,分别在原核生物蓝藻和单细胞真核生物四膜虫中鉴定和筛选了潜在的汞离子转化相关基因,包括半胱氨酸合成酶、胱硫醚-β-合成酶和半胱氨...     

重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定

人核糖核酸酶抑制因子(Human ribonuclease inhibitor, hRI)是细胞质中的一种酸性糖蛋白,可以与血管生长因子(Angiogenin, Ang)紧密结合从而抑制血管形成.利用全基因组合成法合成针对人核糖核酸酶抑制因子基因(hri)的发夹shRNA序列,亚克隆到siRNA表达载体pKD;重组载体经酶切鉴定后,用脂质体法与报告基因绿色荧光蛋白重组融合的人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri共转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测干扰效果.用Image-Pro plus 4.5软件对绿色荧光照片半定量分析干扰效率.结果表明,荧光显微镜显示B16中表达的绿色荧光被干扰,荧光强度半定量分析干扰效率可达80%以上.成功重组构建了针对hri的siRNA表达载体.图5参9     

检测致畸物的gfp基因工程菌的构建

RecA与UvrA是细胞SOS系统中重要的修复蛋白，在细胞DNA损伤后诱导表达．将报告基因绿色荧光蛋白基因（gfpmut3a）分别置于recA和uvrA启动子调控下，构建成质粒pRecAgfp和pUvrAgfp，并转化E．coli DH5α，构建成检测菌株ERS101和EUS101．试验发现，菌株ERS101和EUS101在致畸物吖啶橙处理后，GFP的表达量增高，菌悬液经507nm的蓝光激发后产生的绿色荧光明显增强，且与吖啶橙的浓度具有一定的相关性，即使在0．5μg mL^-1的吖啶橙诱导下也能检测到荧光增强效应．对硝基酚等多种致畸物处理后的检测菌株均有荧光增强效应．图4表1参9     

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)工程菌株田间残留和扩散的追踪检测

分别在北京和江苏省连云港市对携带Btcry基因的荧光假单胞菌工程菌进行了田间残留与扩散的追踪检测 .对越冬前后的试验地和保护地土壤样品进行抗生素抗性平板分离 ,能检测到极少量的具有与出发菌株相同抗性的荧光假单胞菌菌落 ,但没有发现工程菌株的残留与扩散 .对江苏试验地样品还进行了工程菌株质粒卡那霉素和壮观霉素抗性标记基因的抗性菌落分离 ,绝大多数样品中都能分离到包括荧光假单胞菌在内的抗性菌落 ,土样中菌密度n(cfu) =10 4 ～ 10 5g-1,但进行Btcry基因PCR -RFLP检测时没有从样品中得到特异扩增产物 .研究结果表明 :工程菌株抗性标记基因在自然界广泛存在 ,工程菌在株环境中没有残留和扩散 ,具有良好的生物安全性 .表 4参 8     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

荧光传感器阵列检测农药污染物研究进展

农药的滥用已造成严重的环境污染,因此开发高效、简便和灵敏的农药检测技术是环境科学领域的研究焦点.荧光传感检测因其灵敏度高,检出限低,操作简单,成本低,目前已逐渐成为农药快速定量检测的一个发展方向.然而,在真实样品检测环境中,污染物不是单独存在的,常伴随结构或化学性质上与待检测分析物相似的污染物进行干扰.而基于阵列的荧光...     

石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用

masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因,利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点.但目前所用方法存在扩增效率低,方法灵敏度较差的问题.本文根据引物设计原则,利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物,将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线.优化后的体系（20μL）为：FastStart Essential DNA Green Master 10.0μL,上下游引物各0.4μL,RNase-Free Water 4.2μL,5.0μL DNA模板.利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61℃和57℃.优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%,比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%,具有更高的重复性和灵敏度.利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明,石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因,所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因.     

自动荧光法测定大气及其降水中的过氧化氢

最近几年发展起一种测定大气及其降水中过氧化氢的分析技术,其基本原理是过氧化氢在过氧化酶催化下与对羟基苯乙酸(POPHA)反应生成具有荧光的POPHA的二聚物,为了区分样品中的过氧化氢和有机过氧化物,建立了一种新型的双通道化学流动体系,能分别测定总的过氧化物浓度和有机过氧化物浓度,过氧化氢浓度就是两者测定值的差值。荧光物质的检测使用了常规的荧光检测技术,降水样品的检测限量达到0.4ppb,气相样品的检测限量达到30ppt,对体系进行了环境中各种可能干扰因素的实验,未发现任何干扰。     

空肠弯曲菌的快速检测方法研究与应用

为提高空肠弯曲菌的检测效率和检出率，应用免疫磁珠技术自行制备弯曲菌免疫磁珠，用以直接捕获受检样品中的空肠弯曲菌，不需要增菌培养；设计了检测空肠弯曲菌鞭毛蛋白A（flaA）基因的引物与荧光标记探针，首次建立了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光聚合酶链式反应快速检测及鉴定方法．应用于实物检测的结果表明，该方法具有灵敏度高、选择性好、简便等特点，可在24h内完成检测，提高了环境样品及食品中空肠弯曲菌的检出率．图4表1参9     

利用微生物检测环境有机化合物的致突变性

运用微生物检测致突变性的方法有很多种，一般都是简便，快速，灵敏，并且样品用量较少，非常适合检测环境有机化合物的致突变性或潜癌性，如果同时用几种方法，则更有说服力，本文介绍了Ａｍｅｓ试验，微量向前突变法和ＳＯＳ显色试验，以及它们的应用实例。     

Ames测试不确定性分析

Ames测试具有实验周期短、简便的优点,是目前普遍采用的检测化合物致突变性的初筛方法,但Ames测试仍有一定的不确定性.本文主要依据本实验室的研究结果分析了Ames测试中测试菌株、统计回复子数目的时间及2倍判定标准给测试结果带来的不确定性,对影响Ames测试结论存在假阳性及假阴性的因素做了进一步分析与讨论.图6表1参19     

Assessment of mutagenic potency of source water treated by ozone and adsorption processes

This research utilized the Ames test to determine the mutagenicity of water treated by advanced processes, including ozonation and granular activated carbon (GAC). Raw water samples for this research included those obtained from the Pan Hsin waterworks as well as samples containing humic acids. Treated samples were collected from the pilot‐scale advanced treatment plant. The Ames test was used to measure the mutagenicity of the water after each treatment process. For the Pan Hsin raw water samples treated with ozone or GAC, it was indicated that, regardless of whether samples were preozonated or not, they all showed a mutagenic potency less than 2 once the S9 enzyme was added. This level of mutagenicity is insignificant. The prepared humic acid samples, on the other hand, demonstrated a significant reduction in mutagenicity after the pre‐ozonation process, indicating that preozonation can lower the degree of mutagenicity. Furthermore, the mutagenicity of the prepared humic acid samples gradually decreased after the advanced treatment process. However, when chlorine was added later to these samples, the mutagenicity increased again. This research shows that the use of O3/GAC processes to treat water can successfully lower mutagenicity, indicating a great potential for applications in the treatment of drinking water.     

氧化石墨烯遗传毒性的实验研究

研究氧化石墨烯(GO)的遗传毒性,考察其致突变作用,为GO在生物领域的安全应用提供依据。采用Ames试验、体外CHL细胞染色体畸变试验和小鼠体内染色体畸变试验,分别在细菌水平、细胞水平及整体动物水平研究GO的遗传毒性。GO各剂量组的Ames试验结果为阴性。CHL试验中,CHL细胞染色体畸变率随GO浓度的增加而升高,其中1.000 mg·mL~(-1)剂量组(+S_9)和0.500 mg·mL~(-1)剂量组(-S_9)畸变率显著升高(P 0.05)。小鼠骨髓细胞染色体畸变试验中,骨髓细胞染色体畸变率同样随GO浓度的增加而升高,1.000和0.500 mg·kg~(-1)剂量组的畸变率显著提高(P 0.05)。虽然Ames试验结果没有反映出GO的遗传毒性,但在体外及体内染色体畸变试验中,GO均表现出对哺乳动物细胞染色体有潜在的遗传毒性。     

利用SOS/umu测试方法鉴定沙颍河河水中的遗传毒性物质

采用HPLC分割导向的SOS/umu测试方法鉴定了沙颍河河水中的遗传毒性物质。当采用TA1535/pSK1002菌株测定HPLC分割的各馏分时,如果不经大鼠肝微粒体酶(S9)代谢活化,只有馏分F10显示遗传毒性,加入大鼠肝微粒体酶代谢活化后,馏分F10和馏分F15都显示有遗传毒性,说明河水中存在某些需经过大鼠肝微粒体酶代谢活化才能显示出遗传毒性的物质。当采用过量表达O-乙酰转移酶(O-AT),对芳香胺类物质和硝基芳烃化合物有特殊响应的NM2009菌株测定时,馏分F8、F9和F10均呈现遗传毒性;特别是对于馏分F10,用NM2009菌株测定的遗传毒性远高于原始菌,说明这3个馏分中都含有芳香胺类或硝基芳烃类物质。     

二氧化氯和液氯消毒饮用水致突变性的比较

本文运用国内外广泛应用的Ａｍｅｓ试验,对二氧化氯与液氯消毒水样进行了致突变性的比较,结果表明,ＣｌＯ２消毒的水样未显示出致突变性,而液氯消毒的水样显示致突变性的研究结果为ＣｌＯ２在饮用水消毒中的应用提供了科学的依据。     

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.     

Association of color and feeding deterrence by tropical reef fishes

Summary. While many marine molluscs have been suggested to use aposematic coloration to avoid predation, few studies have tested the ability of marine predators to learn to associate colors with distasteful prey. In field experiments, we tested the ability of two populations of reef fishes to discriminate among red, yellow, and black artificial nudibranch models when one color was paired with a feeding deterrent. We offered fishes (1) the models without any feeding deterrents, (2) the models with a feeding deterrent coated onto one color, and (3) the models without deterrents again. If reef fishes learn to associate colors with noxious prey, we expected the color paired with the feeding deterrent to be eaten less frequently in the final assay than the initial assay. In both populations, fishes formed clear associations between color and feeding deterrence. However, when the experiment was repeated in one population, changing the color paired with the feeding deterrent, fishes did not form an association between color and feeding deterrence. In this case, prior learning may have affected subsequent trials. Our study indicates that common colors of nudibranchs are recognizable by fishes and can be associated with noxious prey. Received 24 September 1998; accepted 18 December 1998.     

镉、汞、锌3种重金属的雌激素样作用（Estrogenic Activity of Cadmium, Mercury, and Zinc）

为探讨镉、汞、锌3种重金属的雌激素样作用,采用双杂交酵母法测定了醋酸镉、氯化汞、醋酸锌单独作用时对重组基因酵母β-半乳糖苷酶诱导活性的EC50值.实验结果表明,醋酸镉浓度为1.0×10-5mol·L-(1实验浓度范围10-7~10-2mol·L-1),氯化汞浓度为5.0×10-7mol·L-(1实验浓度范围10-9~10-5mol·L-1),醋酸锌浓度为1.0×10-4mol·L-(1实验浓度范围10-9~10-2mol·L-1)时对酵母β-半乳糖苷酶诱导活性最大,分别达到1.3、0.95和1.1U.不能求出镉、汞、锌单独作用时对β-半乳糖苷酶诱导活性的EC50值.一味计算EC50值不仅难以评价重金属的雌激素活性,而且限制重组受体基因酵母法的普遍运用.一些重金属通过MCF-7细胞法(E-screen)呈阳性,通过重组hERα酵母法YES检测呈阴性,有可能是重金属通过与ERβ作用而产生效应.若构建出含ERβ基因的双杂交酵母菌株,与现有的方法互补将能完善环境雌激素的体外测评系统.     

用SOS/umu测试评价光电催化降解五氯酚过程的遗传毒性特征

采用SOS/umu测试研究了五氯酚水溶液在光电催化反应过程中的遗传毒性变化及降解产物对鼠伤寒沙门氏菌TA1535/pSK1002的细胞毒性,并与五氯酚在直接光解、光催化反应过程中的降解产物进行了比较.五氯酚光电催化降解过程中降解产物对测试菌种的细胞毒性逐渐降低,产物经代谢活化的细胞毒性低于直接光解、光催化降解五氯酚的产物.五氯酚经光电催化降解15￣45分钟的产物经代谢活化测试结果呈阳性,在60￣120分钟的降解产物呈阴性,说明五氯酚的光电催化降解过程中生成了间接遗传毒性物质,但该类物质能够在光电催化过程中被去除.而五氯酚经直接光解、光催化处理120分钟的产物均具有遗传毒性风险.本研究结果表明光电催化技术的环境安全性优于直接光解、光催化技术.此外,SOS/umu测试作为一种简单、灵敏的遗传毒性物质检测方法,适合于评价光电催化技术的遗传毒性特征,可以作为评价该技术环境安全性的生态毒理学方法之一.