青鱼ERRα的克隆、序列分析、组织表达及其对不同EDCs暴露的响应

内分泌干扰物质(EDCs)可以通过多种通道影响鱼类的生长、发育和繁殖, 而雌激素相关受体(ERR)是一类目前没有引起足够重视的潜在致毒信号通道. 本研究克隆了青鱼(Oryzias latipes)ERRα mRNA全序列, 并通过实时定量RT-PCR方法对其在不同组织中的表达和不同EDCs暴露下的响应进行了分析.发现青鱼ERRα与其它脊椎动物ERRα氨基酸序列有较高的同源性,特别是DNA结合结构域(DBD)在从鱼类到哺乳类动物的进化过程中高度保守, 配体结合结构域(LBD)序列与哺乳动物的LBD有66.4%～67.0%的序列相同. 青鱼ERRα与青鱼雌激素受体ERα、ERβ和雄激素受体ARα、ARβ的DBD氨基酸数相同, 且有较高序列相似性, 但LBD的长度和序列差异较大. 青鱼ERRα基因有5个外显子组成,位于第14号染色体. 青鱼ERRα基因在各组织中广泛表达,其中在性腺、脑、脾脏、眼和肠中表达较高,且在雌雄性腺中差异表达,表明其在雌雄性别分化和性腺发育中发挥调控作用. 暴露200 ng/L炔雌醇(EE2)、200 ng/L雌酮(E1)、200 ng/L己烯雌酚(DES)、 100 μg/L阿特拉津(AT)和200 ng/L雌二醇(E2)后, 青鱼精巢中ERRα mRNA水平分别显著下降至对照组的0.54、　0.56、　0.61、　0.63和0.65倍(p<0.05), 但暴露1 μg/L三丁基锡和1 μg/L三苯基锡后上升至对照组的1.34和1.35倍(p>0.05),表明ERRα可能参与外源EDCs影响鱼类性别分化和性腺发育的过程. 此外,在青鱼ERRα基因上游没有发现类似哺乳动物ERRα基因上游的类固醇激素反应元件半位点, 说明鱼类ERRα基因的调控模式与哺乳类存在差异.     

长期暴露于全氟十三酸的青鳉鱼体内分布和生物富集

研究了将青鳉鱼长期暴露于不同浓度的全氟羧酸类物质全氟十三酸(PFTriDA)后的器官分布和富集系数.结果显示, PFTriDA最高富集在性腺;其次是卵、肝脏;浓度最低的部分是残体.除了性腺之外,该器官分布与野生中华鲟的一致.在相同暴露浓度下,雄鱼体内各器官的PFTriDA的含量高于雌鱼,机理模型计算进一步表明高母子传递系数是造成雌雄差异的可能原因.随着PFTriDA暴露浓度的升高,鱼体内同一器官的生物富集系数(BCF)呈现下降趋势.     

实时定量RT-PCR方法检测雌二醇诱导原代培养青鳉鱼肝细胞的基因表达

利用原代培养的雄性青鳉鱼肝细胞进行了相同雌二醇(E2)浓度(100 nmol·L-1)下的不同时间(2、4、6、8d)和相同暴露时间(4d)下的不同浓度(1、10、100、1000、10000 nmol·L-1)的雌二醇(E2)实验,采用实时定量RT-PCR方法对青鳉鱼VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERα的基因表达进行了研究,结果表明,VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERα的基因表达与E2的暴露浓度呈现很好的剂量-效应关系,且1nmol·L-1E2暴露就能显著诱导肝细胞内VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERα的基因表达.作为生物监测雌激素活性的in vitro方法,实时定量RT-PCR的灵敏度高于其它已经发表的方法.因此,实时定量RT-PCB方法与原代培养青鳉鱼肝细胞相结合的方法在环境雌激素效应的评价上具有很大地应用潜力.     

利用SOS/umu测试方法鉴定沙颍河河水中的遗传毒性物质

采用HPLC分割导向的SOS/umu测试方法鉴定了沙颍河河水中的遗传毒性物质。当采用TA1535/pSK1002菌株测定HPLC分割的各馏分时,如果不经大鼠肝微粒体酶(S9)代谢活化,只有馏分F10显示遗传毒性,加入大鼠肝微粒体酶代谢活化后,馏分F10和馏分F15都显示有遗传毒性,说明河水中存在某些需经过大鼠肝微粒体酶代谢活化才能显示出遗传毒性的物质。当采用过量表达O-乙酰转移酶(O-AT),对芳香胺类物质和硝基芳烃化合物有特殊响应的NM2009菌株测定时,馏分F8、F9和F10均呈现遗传毒性;特别是对于馏分F10,用NM2009菌株测定的遗传毒性远高于原始菌,说明这3个馏分中都含有芳香胺类或硝基芳烃类物质。     

中国居民碘营养健康风险评估

我国碘元素的天然分布极不均匀,因此对地域差异缺乏考虑的全民食盐加碘政策(USI)并非碘缺乏病的最适宜的防控策略,甚至还增加了"碘过量"导致的潜在健康风险。近年来,中国卫生部多次调整食盐加碘政策,但亟需从健康风险评估的角度对该政策进行科学的论证和解读。通过解析全国碘缺乏病监测数据中8～10岁儿童尿碘浓度的数据,采用有阈值的剂量效应曲线,评价了中国居民碘营养健康状况,并计算出全国31个省级地区8～10岁儿童因碘过量导致的"亚临床甲状腺功能减低(亚甲减)"的发病率,最后利用5%基准剂量(benchmark dose,BMD),并结合我国居民膳食营养结构的调查结果,提出了考虑地域差异的分层次的食盐加碘量推荐值上限。研究表明,我国居民尿碘浓度分布有明显的区域性特征,尿碘浓度几何平均值和几何标准差分别为168.17和2.24μg·L-1,由于碘摄入过量导致的亚甲减发生率为4.00%。低水碘地区(水碘浓度低于150μg·L-1)的食盐加碘量推荐值上限为29.62mg·kg-1;中、高水碘地区(水碘浓度高于150μg·L-1)的居民通过非碘盐途径摄入的碘量已高于日可耐受最大摄入量,不宜再食用加碘食盐。这些结果基本支持了我国调整后的现行食盐加碘政策,即各地区根据当地人群实际碘营养水平,选定适合本地的食用盐加碘量。     

北京温榆河流域耐药大肠杆菌的调查研究

采用滤膜法结合大肠杆菌显色培养基,调查了北京地区温榆河流域氨苄青霉素、四环素、磺胺(磺胺甲厄唑-甲氧苄啶联用)和左旋氧氟沙星4 类抗生素耐药大肠杆菌的发生情况.结果表明,温榆河流域总大肠杆菌数为10³~10⁷ 个/L,耐药大肠杆菌数为0~10⁶ 个/L;大肠杆菌对氨苄青霉素、四环素和磺胺耐药率分别为10%~35%、5%~25%、10%~35%,而使用时间最短的左氧氟沙星耐药率则低于15%;受渔场排放影响的采样点,四环素耐药大肠杆菌数量显著高于该点其他抗生素耐药大肠杆菌数量,而左氧氟沙星耐药大肠杆菌数量百分比相对较高的采样点推测可能源于人类排放.     

诺氟沙星的氯化反应及其遗传毒性的变化

分别以诺氟沙星初始浓度为10μg·1-1和25 mg·1-1进行氯化消毒实验,用HPLC和SCS/umu遗传毒性测试方法,分别测定不同氯化消毒反应时间后残留诺氟沙星的浓度和遗传毒性,反应速度常数分别为0.0243 min-1和0.0226 min-1;在高浓度反应组,反应45 min后反应液的遗传毒性效应有明显的提高,其EC50为131 nmo·1-1,低于反应前的EC50(181 nmol·1-1),表明在反应过程中生成了遗传毒性高于母体的中间产物.     

定量RT-PCR检测雌二醇诱导的青鳉鱼基因表达

采用实时定量RT-PCR(Q-RT-PCR)方法,对暴露60d雌二醇的雄性青鳉鱼肝脏内卵黄蛋白原(VTG)和卵壳前体蛋白(CHG)基因表达进行研究.结果表明,0.1,1.0,10.0,100.0ng/L的雌二醇使肝脏内VTG-I,VTG-II,CHG-L和CHG-H基因表达被显著诱导.其中VTG-I显示出较好的剂量—效应关系,是较为理想的生物标记物基因.在0.1ng/L雌二醇暴露组中,VTG-I和VTG-II的表达量均显著高于对照组(P<0.05),表明本方法具有检测环境中低剂量雌二醇暴露的潜力.     

全国23个城市水源水中邻苯二甲酸酯代谢物浓度调查

采用UPLC-MS/MS方法对中国23个城市的90个自来水厂141个水源水样中5种常用PAEs的8种代谢产物进行检测.结果发现,所有自来水水源水中均检出了MPAEs,邻苯二甲酸单正丁酯（MnBP）检出浓度最高,为74.7ng/L.水源水中邻苯二甲酸单乙酯（MEP）,邻苯二甲酸单异丁酯（MiBP）和MnBP浓度与邻苯二甲酸二乙酯（DEP）,邻苯二甲酸二异丁酯（DiBP）和邻苯二甲酸二正丁酯（DnBP）浓度分别呈显著相关,表明两者可能是同源.邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）二级代谢产物所占DEHP一级、二级代谢产物浓度和（∑DEHP）为4.0%±5.6%,和天然水体中DEHP的微生物降解结果类似,水源水中的MPAEs可能来自PAEs在自然水体中的微生物降解.     

具有LXRα活性效应物质的新型筛查方法研究

为了检测环境中潜在的LXRα效应物质.本研究以LXRα蛋白为例,利用核受体蛋白与小分子亲和结合的原理,构建了pCold-TF-LXRα重组蛋白并优化了重组蛋白的表达条件,建立了特异性捕获活性物质的方法.结果表明：诱导温度为20℃、诱导剂IPTG浓度为0.4mmol/L为重组蛋白的最佳表达条件;同时,利用LXRα激动剂T0901317 4个梯度浓度（0.25,2.5,25,250μg/L）的加标回收率实验测得线性回归曲线为y =0.83604x+0.40763,R²=0.9948,证明方法具有有效性;对比pCold-TF空载体蛋白（6.42%）和重组蛋白（79.83%）对T0901317（250 μg/L）的回收率,说明方法具有特异性.为了验证方法的实用性,将重组蛋白与15种典型的有机磷酸酯类化合物（OPEs）的混合标样进行“捕获”实验,证明了TPHP、BPADP、TCrP、EHDPP、TNBP、RDP、TEHP、TDCIPP具有LXRα的活性效应.最后,用酵母双杂交实验验证了这8种OPEs均为LXRα的拮抗剂.