不同光照下盐生杜氏藻光捕获蛋白基因lhcb和叶绿素a合成酶基因cao的表达变化

由于光捕获天线蛋白(LHCⅡ)编码基因(lhcb)家族同源性较高,以往研究只能从总体上反映家族基因的变化,对各个编码基因的表达研究较少.本研究以光合单细胞生物盐生杜氏藻(Dunaliella salina)为材料,应用实时PCR的方法,系统研究了lhcb基因家族成员在光环境转换过程中的表达变化.结果表明,当由正常培养光环境转移到高光条件下时,lhcb基因家族成员的表达整体上受抑制,但各个基因的表达变化趋势随时间变化不尽相同.在强光照下,lhcb1、lhcb2.1、lhcb2.23h时有最低的表达积累量,而lhcb3却有较高的表达量.细胞转入黑暗环境后,各个基因的转录水平升高,变化趋势基本相同,在3h时均有较高的表达量,只有lhcb2.1在1h时的表达量最高.叶绿素加氧酶编码基因cao的变化与lhcb3基本相同.LHCⅡ蛋白量在高光下降低,在黑暗条件下升高.叶绿素含量在高光条件下明显下降,叶绿素a/b值升高,黑暗条件下则相反.     

非生物胁迫对盐生杜氏藻DsMPK转录、翻译和磷酸化修饰的影响

促有丝分裂活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK或MPK)途径是在真核生物中广泛存在的调控多种生理过程的信号途径,在细胞增殖、分化、凋亡、生物和非生物胁迫等生理过程的调控中起着关键的作用.盐生杜氏藻(Dunaliella salina,盐藻)是目前世界上最耐盐的真核光合生物之一.在前期实验中,已发现盐藻MAPK(DsMPK)的表达受到低温和高盐胁迫的抑制.分析DsMPK在高温、低盐、氧化、紫外胁迫中的表达变化,发现DsMPK还受到氧化胁迫的抑制.进而分析DsMPK在高温、低盐、氧化、低温、高盐和紫外胁迫中翻译和磷酸化修饰的变化,发现除低盐胁迫外,在磷酸化修饰水平DsMPK同样受到各种非生物胁迫的抑制.在对不同生长阶段盐藻DsMPK磷酸化变化的分析中还发现,DsMPK的磷酸化水平与生长速率有一致性.各方面DsMPK的变化趋势说明其为一调控生长相关的MAPK.     

小麦苗期叶片PSⅡ结构与功能对光胁迫的响应

以扬麦 5号苗期叶片的类囊体膜和PSⅡ颗粒为对象 ,测定光胁迫条件 (2 50 0 μmol·m- 2 ·s- 1 )下PSⅡ组分和功能特性的变化。光逆境条件下 ,类囊体膜及PSⅡ颗粒的放氧活性明显下降。室温下荧光发射光谱的测定结果也表明 ,光逆境处理导致类囊体膜及PSⅡ颗粒荧光发射强度下降。多肽组分变化的分析显示 ,PSⅡ颗粒外周蛋白OEC 33 0 0 0u多肽对光胁迫响应最为敏感 ,降解较显著 ,外周蛋白OEC 1 70 0 0、2 3 0 0 0u和行使光能捕获功能的CP43多肽也先后有不同程度的降解     

TMV感染烟草叶片类囊体膜对热胁迫更敏感

分别利用吸收光谱、荧光发射光谱、温和电泳和SDS-PAGE的方法分析比较热胁迫(35～65℃)对TMV感染或未感染TMV的烟草叶片类囊体膜结构和功能的影响.结果表明,未感染TMV的叶片类囊体膜可见光区吸收峰强度在25～45℃温度范围内随处理温度升高而增加,而TMV感染的几乎没有变化;未感染TMV的叶片类囊体膜叶绿素a荧光发射峰强度也随处理温度显著变化,35或45℃时荧光峰强度分别降低了19.5%和37%,65℃时减少到23.3%,而TMV感染的也显著降低.温和电泳和SDS-PAGE结果表明,热胁迫均引起感染TMV或未感染TMV的叶片类囊体膜色素蛋白发生明显变化,如游离色素叶绿素增多,光系统Ⅱ和I复合体解聚成单体,类囊体膜上的重要功能蛋白含量减少,产生聚合物,尤其经TMV感染引发的该变化更加明显.说明TMV感染烟草提高了类囊体膜对热胁迫的敏感性.     

2种鼠尾草对模拟酸雨胁迫的耐受性比较及其生理机制研究

为探究2种具有较高药用和观赏价值的鼠尾草对酸雨的耐受性及其生理机制,以美丽鼠尾草(Salvia meiliensis S.W.Su)和贵州鼠尾草(Salvia cavaleriei Lévl.)为试验材料,分析了2种鼠尾草在不同p H(6.8、5.6、4.5、3.5和2.5)模拟酸雨胁迫下伤害等级、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及丙二醛和有机渗透调节物质含量的变化。结果显示:模拟酸雨对美丽鼠尾草的伤害程度高于贵州鼠尾草;随着p H的下降,2种鼠尾草叶片叶绿素a、b和总含量逐渐降低,但贵州鼠尾草叶片叶绿素a、b和总含量高于美丽鼠尾草,并以较高的叶绿素a/b适应模拟酸雨胁迫;2种鼠尾草在模拟酸雨胁迫下产生了适应性反应,表现为叶片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量以及超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的升高,但这一适应性反应被降低的过氧化氢酶活性严重削弱;模拟酸雨胁迫下,贵州鼠尾草叶片SOD、POD和CAT活性均高于美丽鼠尾草,叶片MDA含量低于美丽鼠尾草。研究表明,尽管美丽鼠尾草渗透调节能力很强,但其抗氧化酶活性、叶绿素含量和叶绿素a/b都低于贵州鼠尾草,使其膜脂过氧化程度较高、对光能的吸收和转化效率较低,是其对模拟酸雨的耐受性低于贵州鼠尾草的重要原因。     

盐生杜氏藻CPD光裂合酶FAD结合结构域Gln336在逆境胁迫下的修复活性

为了解盐生杜氏藻环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光裂合酶的作用机制,通过定点突变的方法对其黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域α13中保守氨基酸残基Gln336进行突变,并比较野生型菌株PGEX-4T-1-Ds PHR2(WT)和突变菌株PGEX-4T-1-Ds PHR2-Q336H(Q336H)表达的光裂合酶在体内外的光修复活性及其在不同盐浓度下修复光损伤的效果.结果显示:采用Dpn I法定点突变,成功获得盐生杜氏藻CPD光裂合酶突变体Q336H的基因,构建表达载体并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建了突变菌株Q336H.体内外活性研究发现,野生型菌株的CPD光裂合酶的活性显著大于突变菌株Q336H(P0.05).在不同盐浓度条件下,野生型菌株存活率基本没有变化,而突变菌株Q336H随着盐浓度增加存活率迅速下降.在体外修复实验中,甘油浓度对突变酶Q336H活性影响显著大于对CPD光裂合酶活性影响(P0.05).甘油浓度增加导致突变酶Q336H修复活性逐渐下降,而CPD光裂合酶活性变化趋势是先增加后下降.因此,Gln336对盐生杜氏藻CPD光裂合酶活性具有重要影响,而且可能是该酶在盐胁迫下发挥功能的关键氨基酸残基.     

渗透压对产甘油假丝酵母磷酸果糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的调控

磷酸果糖激酶(PFK)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)分别是糖酵解途径(EMP)途径和磷酸戊糖途径(HMP)途径的关键酶,控制着流入两种途径的葡萄糖流量,对耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高效合成甘油、抵抗渗透压胁迫非常重要.为考察渗透压对产甘油假丝酵母这两个关键酶的影响,首先克隆得到编码产甘油假丝酵母G6PDH的Cgzwf基因及编码PFK亚基的Cgpfk1和Cgpfk2,并通过生物信息学分析、酶活检测及基因互补实验验证它们的功能.渗透压胁迫发酵(添加50 g/L NaCl)结果显示,菌株生物量未受渗透压影响,但甘油积累量增加了2倍.与对照相比,盐胁迫激活PFK但弱化了G6PDH活性.此外,盐胁迫下PFK活性表现出更为明显的先降低后升高的趋势,而G6PDH活性的变化则与对照基本相似,表明盐胁迫下碳流可能存在EMP-HMP-EMP形式的不同程度偏转.转录水平检测发现,在发酵中的甘油积累过程盐胁迫对上述酶基因转录的影响并不明显,表明细胞可能通过酶活性调节而不是主要依赖于转录调节来调控两种关键酶以适应耐渗长期胁迫和甘油合成的需要.综上,产甘油假丝酵母以调节关键代谢酶活性的方式来实现碳硫偏转,高产甘油,从而适应外界渗透压力,这一结果可为阐明产甘油假丝酵母耐高渗和高产甘油机制提供新的信息,为未来代谢改造该菌株打下基础.     

暗处理对油菜子叶类囊体膜色素组成和荧光性质的影响

以蜀杂10号油菜为材料,播种7 d后分别置于自然光照条件和黑暗环境中进行暗处理,未处理油菜在d 5、d7、d 14、d 17、d 21、d 24和d 27时收集子叶,暗处理油菜于播种d 8、d 10、d 12和d 14时收集子叶.制备油菜子叶类囊体膜,分析色素含量,并进行类囊体膜丙酮抽提液窜温吸收光谱、叶绿素荧光发射和激发光谱以及蛋白质内源荧光光谱的分析.结果显示:与未处理油菜相比,暗处理引起油菜子叶类囊体膜光合色素Chl a和Chl b含量急剧减少,Chla/b比值和叶绿素/类胡萝卜素(Chl/Car)比值持续下降,类囊体膜对叶绿素的捕光能力和受激发能力降低,类囊体膜蛋白质内源荧光强度降低,以及色素蛋白复合物降解.上述结果表明,暗处理诱导油菜子叶快速进入衰老阶段,类囊体膜蛋白组成和色素的光合功能均发生了明显的变化.图10参23     

过表达IbOr基因甘薯增强抗盐性的生理机制

明确转基因甘薯对盐胁迫响应的生理机制,开发种植耐盐性强甘薯对有效利用盐渍化土地和缓解能源危机具有重要的理论与实践意义.以过表达IbOr基因甘薯及其非转基因甘薯为实验材料,通过室内水培试验,研究150mmol/L NaCl胁迫不同时期甘薯叶片光合参数和抗氧化酶活性等变化规律.结果显示,随着盐胁迫时间延长,甘薯叶片中叶绿素、类胡萝卜素含量及叶片净光合速率(P_n)、气孔导度、胞间CO_2浓度、蒸腾速率都显著降低,但转基因甘薯降低幅度更小.盐胁迫3 d后,转基因甘薯叶片中O_2—·和MDA含量分别为61.23μg/g FW和22.51μmol/g FW,而非转基因植株叶片中O_2—·和MDA含量分别达到80.56μg/g FW和31.92μmol,分别是转基因甘薯的1.31和1.42倍,相比于非转基因植株,盐胁迫后转基因甘薯叶片中具有较低水平的O_2—·和MDA含量.甘薯叶片中SOD、POD和CAT的活性在胁迫后都表现出先升高后降低趋势,且转基因甘薯的酶活性显著高于非转基因甘薯.Na~+含量在盐胁迫后也显著升高,胁迫9d后,转基因和非转基因植株叶片中Na~+含量分别达到25.44 mg/g DW和35.08 mg/g DW,分别是处理前的11.47倍和14.83倍,并且转基因甘薯Na~+含量显著低于非转基因甘薯.以上结果说明盐胁迫下转基因甘薯具有较低的活性氧含量并且膜脂的损伤较小,保持了相对较高的叶绿素含量且含较高类胡萝卜素含量进而维持相对较强的光合作用;转基因甘薯抗盐性的增强很可能通过提高甘薯抗氧化胁迫的能力来实现.     

遮阴和盐分对银叶树幼苗光合特性与叶绿素荧光参数的影响

通过比较不同光和盐水平下银叶树(Heritiera littoralis)幼苗的叶绿素含量、光合光响应参数及叶绿素荧光参数的差异,探讨了遮阴和施盐处理下银叶树幼苗的光合生理及适应能力。以银叶树盆栽幼苗为研究对象,以全光无盐为对照,设置遮阴(遮光率为80%)与2.5%盐水处理,经60 d的处理,测定其光合光响应参数、叶绿素荧光参数及叶绿素含量。结果表明,在正常环境下,银叶树光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)及Chla/b分别为1023、28.8μmol·m^?2·s^?1及3.65,属阳性树种。在无盐条件下,遮阴处理导致了叶片叶绿素含量、表观量子效率(AQY)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、PSII最大光化学效率(Fv/Fm)及PSⅡ有效光化学量子产量(Fv'/Fm')的升高,却降低了Chl a/b、最大净光合速率(P′max)、LSP、LCP、暗呼吸速率(Rd)、初始荧光(Fo)、PSⅡ实际光合效率(ΦPSⅡ)、表观光合量子传递效率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)及非光化学淬灭系数(NPQ)。在全光照或80%的遮阴环境下,盐胁迫均使得叶片叶绿素含量、光合光响应参数(AQY、P′max、LSP)及叶绿素荧光参数(Fm、Fv/Fo)显著下降(P<0.05);而在全光环境下,盐胁迫同样显著降低了Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR(P<0.05),但在遮阴环境下,盐胁迫并没有显著降低叶片Fv/Fm、Fv′/Fm′、ΦPSⅡ及ETR(P>0.05)。盐分对叶片叶绿素含量、光合光响应参数(AQY、P′max及LSP)及叶绿素荧光参数(Fo、Fm、Fv、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR及NPQ)的影响高于光照,光和盐对叶绿素含量、光合光响应参数(AQY、P′max及LSP)及叶绿素荧光参数的影响没有交互作用。研究表明,银叶树幼苗表现出较高的耐阴性及对弱光的利用能力;盐胁迫使银叶树幼苗发生了明显的光抑制,PSII的光化学活性降低,过剩光能对光系统的破坏的风险增加,光能转换效率与电子传递能力下降,光合作用效率大幅降低。     

Bt肠毒素基因与plcR基因的相关性及肠毒素对小鼠的急性毒性

用PCR方法检测溶血肠毒素BL、肠毒素T和肠毒素S三种肠毒素基因(hblA、becT、entS)及毒素调控基因plcR在30株苏云金芽胞杆菌株(Bt)中的分布.结果表明,含有hblA基因、entS基因、becT基因及plcR基因片段的Bt菌株分别占66.7%、70%、70%和73.3%.其中,含有plcR基因的菌株都至少含有一种肠毒素基因,不含肠毒素基因的菌株也未检测到plcR基因,说明plcR基因与肠毒素基因有着密切的关系.用3个Bt菌株WB9、HD2和HD9(都含有hblA、becT、entS和plcR基因片段,HD2和HD9经RPLA与TECRA肠毒素检测试剂盒检测具有高滴度)对小白鼠进行口服急性毒性试验.结果表明,所有3种供试菌株的发酵上清液对小白鼠行为和健康没有明显影响,对内部器官(心、肝、肺等)也没有产生病理现象.图5表3参14     

假单胞菌反式氯双烯内酯异构酶基因克隆和序列分析

从土壤中分离得到一株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株GT241-1,从该菌株中克隆出参与降解2,4-二氯酚的反式氯双烯内酯异构酶基因(dcpE).克隆策略是采用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子.经序列测定得知,dcpE基因编码区1062bp.核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明,dcpE与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.图5表1参12     

丛枝菌根真菌砷酸盐还原酶基因RiarsC的克隆和功能分析

丛枝菌根真菌(AMF)在增强植物砷(As)抗性方面发挥着重要作用。已有相关研究表明,接种AMF能提高植物体内三价砷As(III)的比例,AMF可能参与了将五价砷As(V)还原为As(III)的过程从而提高了菌根植物的As抗性,但目前尚缺乏直接分子证据。本文从异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)菌丝中克隆得到了一个砷酸盐还原酶基因RiarsC并进行序列分析。将该基因转入arsC缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)菌株WC3110(ΔarsC)中,通过As(V)抗性生长曲线和As形态测定,分析了该基因的功能。结果显示,RiarsC属于谷氧还蛋白-谷胱甘肽依赖的砷酸盐还原酶家族;RiarsC基因的表达显著提高了As敏感型E.coli菌株对As(V)的抗性,当培养基中As(V)浓度为100μmol·L-1时表现更加明显。As形态分析表明,表达RiarsC的E.coli菌株能够将培养基中71.03%的As(V)还原为As(III);与表达空载体的菌株相比,还原效率提高了61.98%。本研究证明了AMF的砷解毒还原能力,为进一步开展AMF的砷代谢机制研究提供了一定的分子生物学基础。     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因b-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列. 结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸. 实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列. 所获基因与其它动物类群的b-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物b-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守. 系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因β-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列.结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸.实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列.所获基因与其它动物类群的β-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物β-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守.系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

非纯培养物细菌蛋白酶DNA片段的克隆与表达

为了构建更多的蛋白酶基因工程菌,以及进行蛋白酶基因的直接进化研究,从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段.根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物.富集培养胞外蛋白酶产生菌并提取了12个总DNA样品,分别用每对引物在降落PCR (TouchdownPCR, TD-PCR)条件下进行蛋白酶编码序列的扩增.选择了19个长800 ~1 200 bp的扩增片段测序,其结果为: 8个是蛋白酶DNA片段,它们应属于4种不同的蛋白酶基因序列;同一对引物扩增到的基因序列差异性可达到32%,说明只使用基于已知序列的PCR方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的.将克隆到的1个与碱性蛋白酶E (GenBank No.AJ539133)的编码区99%相似的蛋白酶DNA片段插入pTWIN1载体,在大肠杆菌ER2566中进行表达.结果表明,表达的成熟蛋白酶可分泌到培养基中,能在牛奶平板上产生水解圈,对大肠杆菌有致死作用.图5表3参14     

诺氟沙星对海月水母螅状体Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因表达的影响

诺氟沙星(norfloxacin,NFLX)广泛应用于水产养殖中的鱼类细菌性疾病治疗。为探讨诺氟沙星对海洋生物的毒性作用,选择海月水母螅状体为受试生物,考察了不同浓度诺氟沙星和不同暴露时间对GTP结合蛋白(GTP binding protein)、氧化应激蛋白(oxidative stress protein)和热休克70 k Da蛋白(heat shock 70 k Da protein,Hsp70)表达量的影响。结果表明,NFLX对海月水母螅状体的48 h的半致死浓度(48 h-LC_(50))是415.1 mg·L~(-1),NFLX对海月水母螅状体的毒性属于低毒。随着NFLX浓度的升高和培养时间的延长,Hsp70基因在第7天浓度300 mg·L~(-1)时表达量受到显著性诱导(P0.05),较对照组升高9.1倍;GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因的表达量都呈现先急剧升高后降低的趋势。2个基因均在第1天受到显著性诱导(P0.05),分别在NFLX浓度100 mg·L~(-1)和300 mg·L~(-1)时表达量达到最大值,较对照组升高10.15倍和50.5倍。Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因在实验期间都对NFLX表现出较好的响应。     

环境生物技术的应用及发展趋势

环境生物技术在环境治理中起着越来越重要的作用，环境治理要依赖对生物，尤其是对微生物及其生理，生化特性的了解和认识，从而可以对其生理，生化和遗传方面的性能加以利用。文章重点论述了环境生物技术在这些方面的应用及发展趋势。     

基因、摹因、摹因学--摹因研究在中国的现状与问题

正如生物遗传离不开基因,人类文化传递与演化却离不开摹因.正是出于这样的类比,摹因及摹因学才成为当今的新生事物.然而,摹因研究在中国才刚刚起步,在许多急待解决的问题中,怎样寻找摹因性状凸显的样板及相关经验研究的方法成了关键问题.     

人类无精症相关新基因ZNF313启动子的初步分析

采用PCR方法扩增了ZNF313基因的启动子序列,构建了含人ZNF313基因启动子不同片断的荧光素酶报告基因表达体系.以pRLTK为内参照质粒,瞬时转染HEK293T细胞,48h后收集细胞,测定荧光素酶的相对表达活性.结果发现,在ZNF313基因的启动子区域构建了4种荧光素酶报告基因表达体系,即pGL3215(-215bp～ 38bp)、pGL3160(-160bp～ 38bp)、pGL3133(-133bp～ 128bp)和pGL38(-8bp～ 128bp).其中pGL3215表达载体的荧光素酶相对表达活性最高;pGL3160和pGL3133表达载体的荧光素酶相对表达活性几乎相同,且是pGL3215的75%;而pGL38的荧光素酶相对表达活性急剧下降,接近于零.这表明,-133bp～-8bp区域内含有人ZNF313基因转录所必需的启动子序列.生物信息学的分析表明,两个SP1、一个AP2和一个TAg是人ZNF313基因启动子所必需的.图4参19