黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立

阿魏酸酯酶是参与半纤维素降解的重要酶类. 为了提高阿魏酸酯酶的活性和其它性能,本文作者采用RT-PCR技术从黑曲霉CIB 423.1中克隆了编码阿魏酸酯酶A的cDNA,构建了外泌表达的质粒,并将其转化到毕赤酵母GS115进行表达. 通过检测培养液上清中的酶活,表明阿魏酸酯酶已成功在这一体系表达. 同时,本文还建立了快速、稳定的酶活检测体系,为后续对阿魏酸酯酶酶突变体活性进行高通量筛选奠定了基础. 图5 参17     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的原核表达及其活性分析

乙酰胆碱酯酶(ACh E)在神经信号传导过程中起重要作用,是氨基甲酸酯类和有机磷类农药的主要作用靶标.对朱砂叶螨ACh E进行体外表达和纯化,并分析其活性.将朱砂叶螨ace基因序列插入到原核高效表达载体p ET-30a中,构建表达载体p ET-30a/ace,转入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导高效表达;镍柱纯化目的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定目的蛋白;以纯化的螨ACh E为抗原制备抗螨ACh E特异性抗体;改良的Ellman法测定螨ACh E活性.结果获得了相对分子质量(Mr)约为68×103的较高纯度的螨ACh E蛋白,检测大部分为可溶性表达,酶活检测具有乙酰胆碱酯酶活性,并制备了107效价的抗螨ACh E特异性抗体.采用重组ACh E(IC50=5.4 mmol/L)检测毒扁豆碱抑制活性比螨粗酶液(IC50=58.7 mmol/L)灵敏度提高11倍.本研究构建了螨ACh E体外高效表达载体并获得了具有较好活性的重组螨ACh E,可为抗ACh E杀螨剂的体外高通量筛选和以ACh E为靶标的农药残留检测奠定基础.     

基于杀螨剂靶标朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶体外表达的新型杀螨活性化合物筛选

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是保证神经信号在生物体内正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标.本研究在前期朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因原核表达及最适反应条件摸索的基础上,大规模表达纯化朱砂叶螨AChE,进一步研究其酶学性质.研究结果显示,在温度为25℃、其他条件最适的情况下,测定酶K_m值为0.67 mmol/L,K_(cat)/K_m值为13.53 mmol L~(-1) s~(-1).随后,从SPECS化学库筛选到了55个候选AChE抑制性化合物,获得了9个抑制活性优于或相当于毒扁豆碱的朱砂叶螨AChE抑制化合物,并且它们对朱砂叶螨有较好的毒性.本研究为乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选以及以乙酰胆碱酯酶为靶标的农药开发提供了理论依据和实验基础.     

响应面法优化菌株Bacillus sp.W77酯酶发酵条件

为开发适应性好的工业用酶,从深圳福田红树林自然保护区土壤中分离纯化获得一株产耐高温嗜碱性酯酶的菌株,通过形态学和分子生物学初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为Bacillus sp.W77;对所产的粗酶液进行酶活测定,发现该菌产的酯酶的最适反应温度是50℃,最适pH为8.0,且在碱性条件下较稳定;采用响应面法(Response surface methodology)对土壤菌株Bacillus sp.W77的产酯酶条件进行了优化,酵母提取物6.67 g/L,磷酸氢二钾0.56 g/L,硫酸镁0.36 g/L时,此时预测的最大酯酶活力的D405 nm值为1.266,在最佳产酶条件下,优化后酯酶活力的D405 nm值由0.829提高到1.235,实际值达到理论预测值的97.5%.     

油松毛虫感染白僵菌后体内蛋白质、酯酶和多酚氧化酶的变化

采用分光光度法测定了油松毛虫(Dendrolimus tabulaeformisTsai et Liu)3~5龄幼虫被病原物白僵菌(Beau-veria bassiana)感染后,其体内蛋白质的含量和多酚氧化酶活性的变化;结果表明,被白僵菌感染后1~8d,虫体内蛋白质含量持续下降,而未感染的则变化不大;多酚氧化酶(PPO)的活性呈现出先升高后下降的趋势.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了染菌后1~7d幼虫体内酯酶同工酶的变化;结果显示,染菌后的3、4龄幼虫体内酯酶同工酶酶谱与对照相比,酶带数量变化较大,未染菌的为3条酶带,感染病菌后变为1条和2条.与其相比,5龄幼虫染菌后酯酶同工酶的酶带数量没有变化,只是酯酶的活性及含量比对照有明显减弱趋势.图2表5参16     

大肠杆菌乙酰酯酶(AES)的酶学性质

以乙酸香叶酯为底物,对大肠杆菌乙酰酯酶(Acetyl esterase,AES)的酶学性质进行解析,实现将乙酸香叶酯生物转化为香叶醇.结果显示:大肠杆菌AES酶的最佳反应p H范围为6.0-7.5;最适反应温度为30℃;最佳催化时间为2 h;Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)对酶活没有太大影响,而Cu~(2+)、Zn~(2+)明显抑制酶的活性.对AES的动力学研究可知,其米氏常数Km、最大反应常数Vm分别为2.88 mmol/L、1.87 mmol/L.该酶同样可水解乙酸松油酯、乙酸薄荷酯、乙酸香茅酯,分别产生松油醇、薄荷醇和香茅醇.本研究得出了大肠杆菌乙酰酯酶的最适反应条件,可为后期香叶醇的生物合成优化和产量提高以及其他萜醇类化合物的生物合成提供参考依据.     

白眉蝮蛇毒精氨酸酯酶对CHL细胞增殖抑制和染色体畸变的影响

研究了蝮蛇清栓酶的有效成分精氨酸酯酶体外对中国仓鼠肺成纤维细胞 (CHL)增殖和染色体畸变的影响 .精氨酸酯酶的浓度以酶活单位U表示 .细胞增殖抑制试验和染色体畸变试验都用两种方法 :直接法和代谢活性法 .精氨酸酯酶设 3个浓度 :1.0× 10 -3 U /mL ,0 .5× 10 -3 U /mL和 0 .2 5× 10 -3U/mL .其中最高浓度比临床治疗浓度高约10 0倍 .细胞增殖抑制试验采用细胞贴壁培养 ,乙醇固定 ,结晶紫染色 ,单层细胞密度计测定细胞密度 .染色体畸变试验采用给药后 2 4h和 48h收集中期分裂细胞 ,低渗固定 ,制片 ,Giemsa染色 ,观察 10 0个中期分裂细胞的染色体结构异常及多倍体的出现率 .试验结果表明 ,精氨酸酯酶在上述浓度对CHL细胞的增殖没有抑制作用 ,对CHL细胞的染色体结构也没有影响 .表 2参 10     

基于黄单胞菌冰核蛋白N端的表面展示体系建立

为了建立一个自主、高效的细菌表面展示体系,利用野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端结构域,将短小芽孢杆菌脂肪酶展示于大肠杆菌Rosetta 2(DE3)表面.采用细胞分级、脂肪酶活测定和His-tag In-gel stain分析等检测了重组蛋白的表达情况,并进一步检测了不同底物、温度、pH和有机溶剂对酶活稳定性的影响.结果显示融合蛋白在大肠杆菌细胞外膜成功展示,重组菌脂肪酶活为(74.6±4.5)U/g冻干细胞,展示水平为每个细胞表面19 267个脂肪酶分子;展示酶对中长链脂肪酸酯表现出较高的水解活性,最适pH为11.0,最适温度为40℃,且在40℃保温一周仍保持80%以上的酶活.本研究表明基于野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端的展示体系是一种高效、稳定的细菌表面展示体系.     

高选择性手性酯酶产生菌的筛选及应用

从土壤中分离得到230株产酯酶菌株，经反复筛选，从中挑选出一株酶活及选择性均较高的菌株YQ231，该菌株所产酯酶能将外消旋的酯水解为手性醇（环戊烯酮），且该酶优先水解（R）-型酯。经生理生化试验鉴定，该细菌为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。研究了该菌株的产酶过程，结果表明：酶活在24h达最高值。同时研究了该菌株的催化特性，在反应12h时其转化率达48.8％，eep为92.3％，ees为70.3％。图3表2参9     

高效氯氰菊酯急性暴露中斑马鱼相关酶活性和基因表达变化

高效氯氰菊酯广泛地应用于农业生产及日常生活中的害虫防治,但对水生生物却毒性极高。为探究高效氯氰菊酯对斑马鱼的急性毒性,以总超氧化物歧化酶(总SOD)、过氧化氢酶(CAT)和乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性以及相关的基因表达量变化为检测指标,研究其对斑马鱼成鱼的影响。急性毒性试验结果显示,高效氯氰菊酯对斑马鱼属剧毒物质,斑马鱼的急性中毒症状为身体蜷曲、抽搐,鳃盖扇动加快,游动能力减弱,间歇性出现无规律急速游动和撞壁行为。酶活测定结果显示,斑马鱼组织中总SOD、CAT和ACh E活性与高效氯氰菊酯呈现低浓度诱导、高浓度抑制的剂量效应关系;相关基因表达量的检测结果显示,高效氯氰菊酯会诱导斑马鱼肝脏、肠和脑中Sod1、Cat以及Ache的m RNA表达上调。研究表明,高效氯氰菊酯的神经毒性和氧化损伤共同造成了斑马鱼的中毒甚至死亡。     

固氮菌与氮配施对生菜及油菜产量和品质的影响

采用盆栽试验研究了固氮菌(M)与氮(N)配施对生菜、油菜产量和品质的影响.结果表明:施加固氮菌(M2)后,生菜、油菜的鲜重和干重较之不加固氮菌(M1)有显著增加趋势,生菜、油菜的Vc含量分别提高4.2%~18.6%、17.6%~35.0%,还原糖含量分别提高17.6%~35.0%、6.7%~41.3%,硝酸盐含量分别降低40.5%~57.2%、22.8%~40.8%.在所有处理中,处理M2N3的两种蔬菜产量最高,品质最好.研究可为固氮菌肥的合理有效施用、氮肥的优化配比及叶菜类蔬菜高产优质的生物调控提供理论依据.图1表3参13     

乡镇企业可持续发展与小城镇建设

通过对乡镇企业的经济效益、环境效益和社会效益以及小城镇发展的优越性分析可知，乡镇企业不宜在农村发展，应该在小城镇中发展。     

Characteristics of dispersions and water-soluble extracts of crude and refined oils and their toxicity to estuarine crustaceans and fish

The quantitative hydrocarbon composition and behavior in seawater of water-soluble fractions (WSF) and oil-in-water dispersions (OWD) of 4 oils was investigated. Two crude oils, South Louisiana crude and Kuwait crude, and two refined oils, No. 2 fuel oil and bunker C residual oil, were used in these investigations. The WSFs of the crude oils had higher total oil-hydrocarbon concentrations and were richer in light aliphatics and single-ring aromatics than were the WSFs of the refined oils. The WSFs of the refined oils contained significantly higher concentrations of naphthalenes than did those of the crudes. The hydrocarbon composition of the aqueous phase of OWDs closely resembled that of the parent oils. Gentle aeration of the OWDs resulted in a loss of 80 to 90% of the aqueous hydrocarbons in 24 h. Alkanes disappeared from the dispersions more rapidly than aromatics. The WSFs and OWDs of the refined oils were considerably more toxic to the 6 test species than were those of the crude oils. The test species can be ranked according to increasing sensitivity to oil as follows: Cyprinodon variegatus, Menidia beryllina, Fundulus similus, Penaeus aztecus postlarvae, Palaemonetes pugio and Mysidopsis almyra. The results of this investigation are discussed in relation to the potential impacts of oil spills on the marine and estuarine environments.     

恩诺沙星与Cu复合污染对白菜和西红柿根及芽伸长的抑制作用

抗生素恩诺沙星和重金属Cu是当今我国土壤中较常见的污染物。本研究考察了恩诺沙星与Cu复合污染对砖红壤中白菜和西红柿种子的根及芽伸长的影响,以评估恩诺沙星和Cu复合污染潜在的生态风险。结果表明,加入不同浓度的Cu时,土壤中的恩诺沙星浓度与2种作物的根伸长和芽伸长的抑制率均显著相关(P0.05);白菜的敏感性均大于西红柿;白菜和西红柿的根伸长对复合污染的生态毒性的敏感性均较芽伸长更高;与单一恩诺沙星胁迫相比,在恩诺沙星与Cu(100 mg·kg~(-1))或Cu(300 mg·kg~(-1))复合污染下,二者对白菜和西红柿的根及芽伸长抑制效应均表现为协同作用。试验结果在揭示恩诺沙星与Cu复合污染的生态毒性效应的同时,也为重金属和抗生素复合污染的生态风险评价提供科学依据。     

投喂频率和饵料种类对黄颡鱼仔稚鱼生长和存活的影响

研究了以浮游动物为饵料日饱食投喂3次(F3)、2次(F2)、1次(F1)等不同投喂频率对3～32日龄黄颡鱼仔稚鱼生长和存活的影响,并比较了单独投喂浮游动物(Ⅰ组)、水蚯蚓(Ⅱ组)及两者混合投喂(Ⅲ组)对4～34日龄黄颡鱼生长和存活的影响.结果表明:(1)投喂频率对黄颡鱼仔稚鱼生长具有显著影响,F3组个体平均全长、体重显著高于F2、F1组;3～29日龄全长和体重特定生长率(SGR)与投喂频率间直线正相关(SGR1=1.0366D+3.2347,R2=0.9025;SGRW=3.00t3D+9.4829,R2=0.8833),投喂越多则生长越快.(2)17-25日龄时Ⅱ组生长显著低于Ⅰ、Ⅲ组;28日龄Ⅱ组生长仍显著低于Ⅲ组,但与Ⅰ组问没有显著差异;到34日龄,Ⅲ组生长最快,Ⅱ组生长超过Ⅰ组,3组间生长差异显著(P<0.05),表明28日龄后水蚯蚓为黄颡鱼更合适的饵料.(3)饵料种类对34日龄内的仔稚鱼成活率没有影响.试验表明,日饱食3次更有利于黄颡鱼仔稚鱼的生长;28日龄后投喂饵料应增加水蚯蚓;充足的适口饵料是影响黄颡鱼苗种生长的重要因素.图2表2参18     

Individual and combined effect of mercury and manganese on phenol and proline content in leaf and stem of mungbean seedlings

Mungbean (Vigna radiata L. Wilczelk cv. Pusa Baisakhi seedlings were raised in individual (0, 1, 10, 100 and 1000 ppm) and combined solutions (1 : 1, 10: 1, 1: 0 ppm Hg : Mn) of mercury and manganese for 6 days. Phenol and proline were found to accumulate in leaves in response to treatment with heavy metals. The magnitude of accumulation correlated with concentration of metals. However, a reverse trend was noticed in stem for phenol. Accumulation of phenol in response to heavy metal treatment was organ specific and occurred at higher rate in plant parts, which faced the stress mostly. However, accumulation of proline helped the plant to survive stress situation. In combined solutions, amelioration of mercurial toxicity by manganese was recorded.     

磷酸盐和石灰对污染红壤与黄泥土中重金属铜锌的钝化作用

采用外源加入重金属铜锌硝酸盐的方法,制成铜、锌单一及复合的三级污染红壤和黄泥土(Cu 200 mg·kg-1、Zn 400 mg·kg-1),平衡2个月;分别施入磷酸盐、石灰,稳定4个月后测定土壤中有效态铜、锌的含量,以阐明磷酸盐和石灰对重金属污染土壤中铜锌的钝化作用.结果表明,施入磷酸盐稳定120 d后,两种土壤中有效锌含量都显著降低,红壤中有效铜含量降低了8.3.6%,而黄泥土中有效铜含量变化不明显;施入石灰后,红壤中铜锌有效性含量降低了87.6?.3%,黄泥土中有效锌含量降低了90%,而有效铜含量最大降低幅度为47.4%.由此可见,磷酸盐对红壤中铜锌的钝化作用较强,对黄泥土中铜的钝化作用弱;石灰对两种土壤中铜锌的钝化作用都很强;磷酸盐和石灰对单一污染土壤铜锌的钝化固定作用要强于复合污染.     

Bacterial degradation of monocrotophos and phyto- and cyto-toxicological evaluation of metabolites

The bacterium Serratia marsescens strain JAS16 was isolated from agricultural soil which had prior exposure to monocrotophos for three years. The strain JAS16 tolerated up to 1200 mg L^–1 monocrotophos and degraded the insecticide (1000 mg L^–1) at a degradation rate constant of 136 d^?1 (DT₅₀ = 3.7 d). In soil, the degradation rate constant was 105 d^?1 (DT₅₀ = 4.8 d). A schematic pathway is being proposed from the degraded products derived from gas chromatography--mass spectrometry (GC-MS). The phytotoxicity of degradation products to Vigna radiata, Vigna unguiculata, and Macrotyloma uniflorum and the genotoxicity to Allium cepa roots were found to be low. A cost-effective powder-based formulation was achieved with the isolate. The isolate remained viable during the storage and also multiplied with a higher colony forming units (CFU) load g^–1 for over a period of seven weeks of storage.     

甲胺磷和乙草胺对产甲烷菌种群数量及其活性的影响

采用厌氧培养箱、气相色谱技术和MPN计数法,研究了甲胺磷和乙草胺在4种浓度(0 1、0 2、0 5和1 0mg·L-1)下对水稻田土壤产甲烷菌种群数量及其活性的影响。加甲胺磷后7d内刺激产甲烷菌种群的生长,数量增加0.2～44.1倍,每管的产甲烷量增加0.8～2.1倍,且刺激作用随药剂浓度的增加而增强;加乙草胺后7d内,产甲烷菌的生长受到抑制,数量下降了50%～99%,每管的产甲烷量显著减少,且抑制作用随药剂浓度的增加而增强。随着加药时间的延长,甲胺磷和乙草胺逐渐降解,产甲烷菌数量又恢复至原有水平。     

费氏中华根瘤菌ntrBC基因突变株的构建及其特性

从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因文库的重组质粒pGXHN300上获得ntrB、ntrC基因完整序列.通过自杀质粒pK18mob同源单交换的方法,分别获得了HN01菌株的ntrB和ntrC基因的突变株GXHNB、GXHNC.功能检测证明GXHNB、GXHNC能以硝酸盐为唯一氮源进行正常生长,但不能以铵源作为唯一氮源进行正常生长.图4表2参15