聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达

为了构建高效除磷的微生物,将来源于大肠杆菌的聚磷激酶基因(ppk)插入广宿主载体pBBR1MCS-2多克隆位点区,得到质粒pBBR1MCS-2-ppk.以该质粒为模板,通过PCR扩增出携带有载体启动子和终止子序列的ppk基因,插入自杀型质粒pUTmini-Tn5中得到重组质粒pUTmini-Tn5-ppk.pUTmini-Tn5-ppk经三亲接合作用进入Pseudomonas putidaKT2440,同时mini-Tn5通过转座作用将ppk整合到宿主菌株的染色体DNA中,获得基因工程菌Pseudomonas putidaKT2440-PPK,用于表达ppk.RT-PCR结果显示,ppk基因在KT2440-PPK中得到较高量的表达,而在原始菌株KT2440中表达微弱.人工模拟污水实验结果表明,接种1 h时KT2440-PPK中聚磷含量达到最大,为3.05 mg/g,约是对照菌株KT2440的15倍.测定模拟污水中磷酸盐的含量表明,KT2440-PPK可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐.     

微生物聚磷及其酶学调控

本文论述了微生物细胞内磷酸盐转运机制和与聚磷相关的酶—PPK、PPX及两者对微生物聚磷行为的调控,并对今后研究重点做出展望.论文认为对于微生物聚磷的研究应从纯种微生物转移到强化生物除磷系统的混合微生物菌群,运用分子生物学和生物信息学手段分析聚磷优势菌种的PPK和PPX酶的结构特征及其在活性污泥中的变化规律,进一步深入认识生物除磷调控机理,开辟寻求提高系统除磷效率的新途径.     

多聚磷酸盐激酶基因在污水生物除磷中的功能

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk~-Kan~+.将p CP20导入大肠杆菌E.coli/ppk~-Kan~+以消除卡那霉素抗性基因,通过负抗性筛选及正反向引物验证,构建无抗生素抗性的ppk基因缺失工程菌株E.coli/ppk~-Kan~-.比较工程菌株和野生型菌株的生长特性,并比较两者在缺磷诱导/富磷及多次厌氧/好氧诱导条件下的除磷性能.结果表明采用Red重组系统,通过无痕敲除,成功构建了大肠杆菌ppk基因缺失菌株E.coli/ppk~-Kan~-.敲除后的工程菌株和野生型菌株生长整体没有差异,但是4 h前对数期工程菌株生长快于野生型菌株,8 h后稳定期工程菌株生长慢于野生型菌株,表明ppk影响菌体的生长;缺磷诱导/富磷条件下,工程菌株并未表现出因ppk缺失而影响其除磷能力;经过5次厌氧/好氧诱导,两菌菌体含磷量保持在1%~2%,没有因诱导次数的增加而表现出菌体含磷量增加的趋势,也未发现厌氧有PHB好氧有聚磷颗粒生成,表明ppk基因的缺失并没有引起菌体除磷能力的下降.ppk并未表现出明显的与污水生物除磷相关的功能.     

转聚磷激酶基因的大肠杆菌去除水体中的磷

为探索有效的生物除磷方法,构建了聚磷激酶基因(ppk)的表达载体pET28a(+),并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,获得了可过表达ppk基因的工程菌BL-PPK.RT-PCR结果表明,ppk基因在转化的大肠杆菌中得到了高效表达.聚磷试验结果表明,培养10h后,转化了ppk基因的大肠杆菌细胞内聚磷含量比对照菌株高20倍,而培养液中可溶性磷浓度为对照菌株的约1/9.