细菌对偶氮染料的降解及偶氮还原酶的研究进展

综述了目前降解偶氮染料的细菌以及偶氮还原酶的研究进展。探讨了可能的降解机理和相关基因工程菌的开发。     

铅暴露引起的小鼠肝脏抗氧化系统损伤

小鼠暴露于不同浓度乙酸铅1周后,对肝脏还原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、活性氧物质(ROS)、总氧自由基清除能力(TOSC)进行测定.结果显示:小鼠铅暴露后,肝脏GSH水平和TOSC值略有下降;GR、CAT、SOD活性被抑制,在高剂量铅暴露组尤为明显;ROS升高1 5倍.这些结果表明,铅能对小鼠肝脏的抗氧化系统造成损伤.     

SRB固态发酵条件优选及动力学方程建立

为解决利用微生物法处理酸性矿山废水中菌种扩大培养、菌种保存和接种等问题,研究利用固态发酵法制备硫酸盐还原菌(SRB)固定化产品。实验以亚硫酸盐还原酶(SiR)作为菌种活性检测指标,进行生物质粒径、初始含水率、接种量单因素实验,响应面法确定各生物质载体固态发酵的最优条件并验证;用固载产品处理模拟酸性矿山废水数据按照Lineweaver-Burk作图法,建立SRB菌去除SO2-4的反应动力学方程。结果表明,以玉米芯为载体最佳发酵条件为:粒径8~20目、含水率70%、接种量10%,优化后SiR酶活为2.7385 U/g;木屑:粒径1~8目、含水率80%、接种5%,优化后SiR酶活为2.4863 U/g;甘蔗渣:8~20目、含水率75%、接种10%,优化后SiR酶活为4.2960 U/g。固载产品处理模拟酸性矿井水SO2-4,以1/v对1/[s]作图,玉米芯固载SRB菌的图相关性最好y=1176.9x+0.6034,R2=0.9199,建立玉米芯固载SRB菌的处理SO2-4动力学方程为V=1.657[s]/(1950.45+[s])。     

烯酮还原酶基因的克隆与优化表达

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.     

硫酸盐还原菌去除铅的实验研究

考查了初始p H值、反应温度、接种量等对硫酸盐还原菌菌株的生长和对重金属铅去除效果的影响,应用X射线衍射(XRD)、表面能量色谱分析(EDS)对沉淀物进行了表征。结果表明,该菌株生长及去除铅的最佳条件为:p H=8.0,温度30℃,接种量10%,该条件下的去除率高达99.79%。所得到的沉淀物为硫化铅,立方方铅矿结构,结晶度良好。进一步研究了最佳条件下不同初始浓度硝酸铅对硫酸盐还原菌细胞中亚硫酸盐还原酶(SiR)和腺苷酰硫酸还原酶(APS)比活力的影响。结果表明,硝酸铅质量浓度低于950mg/L时,亚硫酸盐还原酶和APS还原酶比活力受到轻微抑制,当硝酸铅质量浓度为1 100 mg/L时,其比活力受到明显的抑制。重金属铅对亚硫酸盐还原酶比活力抑制作用相对明显。     

甲醛诱导哮喘的一种分子机理：对GSNO还原酶的上调作用

为了研究气态甲醛对GSNO还原酶(GSNOR)的上调作用是否通过GSH途径,以昆明雄性小鼠为实验材料,采用动态吸入染毒方式,检测了0、3.0mg·m-3甲醛暴露小鼠以及3.0mg·m-3甲醛暴露同时腹腔注射α-硫辛酸小鼠的肺泡灌洗液中GSH浓度和GSNOR活力.结果表明,3.0mg·m-3甲醛暴露小鼠与对照组小鼠相比,其肺泡灌洗液中GSNOR活力极显著上升(p<0.01),同时GSH浓度极显著下降(p<0.01);α-硫辛酸注射组小鼠肺泡灌洗液中GSNOR活力较3.0mg·m-3甲醛暴露小鼠有极显著下降(p<0.01),同时GSH浓度极显著上升(p<0.01).甲醛暴露下,GSNOR与GSH呈相反的变化趋势.以上结果表明,气态甲醛可以通过GSH途径调节GSNOR表达.甲醛对GSNOR的上调作用可能是通过诱导氧化胁迫进行的,这可能是理解GSNOR在气道中调控的基础.     

L-山梨糖还原酶基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的酶学特性

为获得L 山梨糖还原酶 (SR)整个操纵子序列 ,以 pGEM 3zf( )作为载体构建了Gluconobactersp .S6基因文库 .结合转化子在以L 山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况 ,利用PCR技术筛选到一个含L 山梨糖还原酶基因的阳性克隆pGEM 3zf( ) sr3/E .coli,酶切鉴定插入片断长度约 5 .0kb左右 .以 pGEM 3zf( ) sr3/E .coli质粒DNA为模板 ,扩增SR结构基因 .PCR产物经测序验证为SR基因序列后 ,与表达载体Pet32a( )相连 ,转化宿主大肠杆菌AD4 94 (DE3)对SR基因进行表达 ,并利用重金属离子亲和层析技术对SR融合蛋白进行了纯化 ,对其酶学特性进行了研究 .结果表明 :还原型辅酶II(NADPH)是SR酶蛋白的最适电子供体 ;SR酶蛋白的最适反应pH为 7.0 ,pH为6 .5时保持稳定 ,酶活力较高 ;最适反应温度是 5 0℃ ,30℃时热稳定性较好 .SDS PAGE电泳分析 ,SR融合蛋白的Mr 在6 5× 10 3 左右 ,由此推测出天然SR的Mr 在 5 3× 10 3 左右 ,与SR基因序列推测出的分子量大小一致 .图 13表 2参 6     

α-萘酚对小球藻谷胱甘肽及其还原酶的影响

研究了--萘酚对2种小球藻谷胱甘肽-包括还型谷胱甘肽GSH与氧化型谷胱甘肽GSSG-含量及其还原酶-GR-活性的影响.结果表明,低浓度--萘酚对藻细胞的谷胱甘肽水平和GR活性有显著的激发作用,随着--萘酚浓度的升高,普通小球藻和蛋白核小球藻的GSH含量、谷胱甘肽总量及GR活性均有所提高,并分别在5mg/L和10mg/L时达到最大值,而GSSG均不断下降且在相同浓度下-2 mg/L-至最小后开始上升.GSSG/GSH先降后升的变化说明藻细胞在--萘酚胁迫下膜脂过氧化加剧,而GSH、GR在清除活性氧、消除过氧化方面起了重要作用.     

醌还原酶 醌类化合物对偶氮染料脱色的作用

外加醌类化合物作介体,利用细菌胞内的醌还原酶考察基因工程菌Escherichia coli YB对偶氮染料的脱色能力,以及甲基氢醌预处理对E. coli JM109和厌氧污泥脱色的影响.结果表明,介体2羟基1,4萘醌（lawsone,LQ）的存在对胞内过量表达醌还原酶AZR的E. coli YB的脱色能力有显著的促进作用,0.2 mmol·L^-1 LQ存在下,苋菜红（1 mmol·L^-1）在2 h内可脱色75%.LQ存在时E. coli YB对高浓度的染料也有脱色效果,8 h可使苋菜红（5 mmol·L^-1）脱色50%左右.与LQ相比,甲萘醌作为介体对脱色的促进效果较差,2.5 mmol·L^-1甲萘醌存在下脱色70%需12 h.LQ存在时E. coli YB对苋菜红的重复脱色能力稳定,12 h内能完成4次重复脱色.LQ的存在对于结构较复杂的2种偶氮染料酸性大红GR和活性艳红K2BP的脱色也有促进作用,在最适LQ浓度下,分别在9 h和30 h脱色70%.甲基氢醌预处理对E. coli JM109和厌氧污泥的脱色能力都有促进作用.预处理后在LQ存在下,E. coli JM109在5 h可脱色苋菜红（1 mmol·L^-1）80%左右,而污泥可在11 h脱色75%以上.     

BioDeNO_x体系中N_2O还原的微生物学验证及参数研究

氧化亚氮(N2O)是BioDeNOx脱硝过程中的主要中间产物,而N2O还原酶是影响NO进行完全反硝化的关键酶。实验以前期从同一反应体系中筛选出的一株反硝化菌Pseudomonas stutzeri ND1为出发菌株,克隆鉴定该反硝化菌是否具有N2O还原酶基因nosZ,并考察了pH、氧气、温度对该反应体系NO去除率以及N2O产生量、转化率的影响。实验证明该菌确实存在N2O还原酶nos,即从微生物学角度表明该反应体系具有N2O的生物还原能力。该反应体系的最适pH值为8.0,此时NO去除率达最大值80%,N2O产量降至0.33mg/m3,N2O转化率为0.06%;在氧气含量小于1%时,N2O产量及转化率变化不明显,NO去除率下降了不到2%,而当氧气含量达到2%时,N2O有了明显的跃升,达到1.5 mg/m3,N2O转化率为0.48%,NO去除率下降至78.6%;反应最适温度为30℃,此时NO去除率达到最大值82%,N2O产量为0.34 mg/m3,且N2O产量随着温度的增加而逐渐增多。