盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.Western Blot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.图7参16     

16S rDNA克隆文库方法对制药废水处理系统中微生物多样性的研究

采用分子生物学构建16S rDNA克隆文库的方法对制药废水交替流生物反应器内的微生物群落进行了多样性研究,该反应器对CODcr、氨氮、石油类化合物以及多种特殊污染物均有较高的去除效率.代表序列的BLAST比对结果表明微生物群落具有高度多样性,优势菌群为Proteobacteria,占78.6%.微生物群落分属7个不同纲,优势顺序为Alphaproteobacteria (39.8%),Betaproteobacteria(23.5%),Gammaproteobacteria(14.3%),Chlorobil(6.3%),Firmicutes(4.1%),Flavobacteria (1.0%),Deltaproteobacteria(1.0%.使用Vector NTI Suite 6.0软件对50个OTU的代表序列和NCBI基因库中最相近的已知细菌16S rDNA序列绘制系统进化树,表明克隆子与已知菌之间的基因系统进化关系.     

一种改进的CSCA+PCA化工过程异常检测技术

为了解决化工过程异常检测时因参数众多且数据庞杂而导致一些异常无法被有效检出的问题,在Brownlee的克隆选择分类算法（CSCA）基础上,通过引入主成分分析（PCA）技术,进行数据降维和数据重整,探讨了人工免疫算法在化工过程异常检测中的适用效果和技术方案,以TE过程数据作为样本进行异常检测和分类实验。结果表明,过程异常数据的规模、属性的数目对CSCA异常检测效果具有明显影响,而通过主成分分析进行数据降维之后,CSCA检测效果有所提高;进一步的数据重整之后,CSCA对过程异常分类辨识的准确率可提升到85%以上;基于CSCA+PCA的数据降维及重构之后的过程异常检测技术方案,可以获得较高的异常检测准确率,从而一定程度上为化工过程安全运行提供技术保障。     

不同短程硝化系统中微生物群落结构的对比分析

为探讨有机碳源对短程硝化系统中微生物群落结构的影响,采用构建克隆文库的方法对模拟无机城市生活污水和模拟实际城市生活污水短程硝化系统中的微生物群落结构进行对比分析.实验结果表明,变形菌门(Proteobacteria)和未培养菌(uncultured bacterium)是两系统中的优势菌群.两系统中的菌群结构存在差异,但优势菌群及其所占比例相似.两系统中的主要脱氮菌类群也相似,但由于有机碳源浓度的不同其菌属及比例有所差异.无机短程硝化系统中的脱氮菌群包括亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、硝化螺菌属(Nitrospira)和Denitratisoma,其中自养硝化菌的比例高于其在有机短程硝化系统中的比例,但仍低于异养菌在该系统中的比例.有机短程硝化系统中的脱氮菌群主要包括β-Proteobacteria中的一些反硝化细菌和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas),其中亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的含量很少.     

再生水湿地香蒲根内生细菌群落多样性及其水质特征分析

以北京白河人工湿地再生水补水河段香蒲根为研究对象,采用16S rDNA克隆文库技术对香蒲根内生细菌群落多样性进行分析,得出该克隆文库包括4大类群细菌,最优势类群为变形杆菌门Proteobacteria,其中包括Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Epsilonproteobacteria、Alphaproteobacteria;其次为厚壁菌门Firmicutes、疣微菌门Verrucomicrobia、拟杆菌门Bacteroidetes;另外还包括部分非培养未确定种属的细菌.结合研究区再生水排放口与湿地下游水质数据,得出TN、TP、NO₃^-去除率达到了42.15%、47.34%、28.56%,表明湿地对再生水中的TN、TP、NO₃^-具有明显去除机制,说明香蒲根内生细菌克隆文库中菌株与湿地氮、磷等生物地球循环关系密切.     

电流对MEC-3DBER-S脱氮除磷效果的影响及机理分析

针对低C/N污水处理厂二级处理出水中氮、磷去除问题,基于三维电极生物膜工艺（3DBER）反硝化脱氮碳源消耗量少的特点,构建了微电凝聚-三维电极生物膜耦合硫自养强化脱氮除磷工艺（MEC-3DBER-S）.对比研究了3DBER与MEC-3DBER-S在不同电流强度条件下的运行特性,并结合基于nirS基因的克隆文库技术分析了MEC-3DBER-S中反硝化微生物的构成.运行结果表明,MEC-3DBER-S有效强化了氮、磷的去除效果,特别是提高了低电流条件下的脱氮效率;同时电流作用能够促进海绵铁腐蚀,提高除磷效果.当C/N=1.5、HRT=8h、I=300mA条件下,其TN和TP去除率分别达到75%和78%,分别比3DBER高10%和28%左右.基于nirS基因的克隆文库结果表明,MEC-3DBER-S中同时存在与具有异养、氢自养、硫自养和铁自养反硝化功能的菌属相似的细菌.该体系中有机碳源、H2、单质硫和Fe²⁺等电子供体可相互补充,强化了脱氮;同时,体系中还存在物化联合生物除磷的作用,强化了除磷.因而,MEC-3DBER-S复合反硝化体系保证了较高的脱氮除磷效果.     

厌氧氨氧化耦合脱氮系统中反硝化细菌研究

采用聚合酶链式反应、分子克隆等分子生物学方法,通过构建nirS克隆文库研究了厌氧氨氧化耦合异养反硝化脱氮系统中的反硝化微生物.进行同源性分析和系统发育树构建,结果表明,从nirS克隆文库中随机挑选的100个克隆子中有51个阳性克隆子,共分为12个操作单元.经比对发现这些微生物主要为变形菌门细菌和未知菌类,其中β-proteobacteria占据绝对优势且有较多种类,少部分属于 γ-proteobacteria.     

黄颡鱼黑色素细胞原代培养及迁移相关基因克隆分析

黑素皮质素受体-1(MC1R)在鱼体中对黑色素细胞的分化及迁移起主要的调控作用,而且在神经系统和免疫系统中表现出不同功能。本研究对黄颡鱼表皮黑色素细胞的培养条件进行探索,并在此基础上对MC1R基因进行克隆,为后续研究黄颡鱼黑色素异常的细胞及分子机理研究提供基础。结果表明,黄颡鱼表皮黑色素细胞在27 ℃培养条件下,72 h开始贴壁生长,培养基中添加20 %小牛血清培养效果比添加10%小牛血清好。MC1R基因克隆方面,黄颡鱼MC1R基因全长为936 bp,编码312个氨基酸,与剑尾鱼(Xiphophorus maculates)、孔雀鱼(Poecilia reticulata)、条斑星鲽(Verasper moseri)、海鲈(Dicentrarchus labrax)、大菱鲆(Psetta maxima)等5种鱼类MC1R基因的同源性分别为97%、96%、90%、90%、90%,系统分析结果显示,黄颡鱼MC1R基因在进化树上的位置与黄颡鱼的分类所处位置基本吻合。证明黄颡鱼表皮黑色素细胞原代培养的条件为：27℃,添加20% 小牛血清,所克隆基因为黄颡鱼MC1R基因。     

松材线虫PCR标准化阳性对照构建及检测体系的建立

建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196 bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100 ps/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.图3表2参8     

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆

促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一是蔗糖合成酶,它也是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶.以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶(Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S.E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%,推导的氨基酸序列同源性达到100%.该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3'不翻译区等,开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr,为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础.