地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM,克隆入表达载体pET-28a(+),转化Escherichia.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,测定麦芽糖淀粉酶酶活性.结果表明,麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达,酶活力为3.797 U/mL,SDS-1PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×103的特异性蛋白质条带.酶学性质分析表明,重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5,在45℃以下的中低温环境保持稳定,且能在比较宽的pH范围内(pH 4.5～8.5)稳定.图3表1参16     

拟南芥基因组中注释为(S)-去甲乌药碱合成酶的分子克隆与异源表达(英文)

至今在拟南芥中尚未发现复杂生物碱,但是其基因组测序则表明有35个以上基因可编码(S)-去甲乌药碱合成酶(NCS).本研究首先以经过生化表征、机理清楚的来自罂粟、日本黄连、黄唐松草和花菱草的NCS为参考,与拟南芥中注释的NCS进行了广泛的生物信息学分析与比对,从中选择5个AtNCS为目的基因,设计特异性引物;从拟南芥中提取总RNA,一步法RT-PCR克隆得到上述基因;通过TA克隆将上述基因转入pGM-T载体,筛选、酶切及PCR鉴定,DNA测序验证它们的核酸序列;将测序验证的AtNCS基因经过PCR扩增、质粒构建、转入Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达和蛋白纯化;在整体细胞、细胞裂解液、细胞裂解液上清和纯化蛋白共4个层次进行了AtNCS酶功能表征,未发现目标产物或新产物的生成;上述基因的具体功能还有待进一步研究.     

基于复合节间组分关系的结缕草克隆植株形态可塑性特征分析

结缕草Zoysia japonica克隆植株的基本形态学单元是复合节间。分析复合节间组分关系,可以进一步揭示其形态可塑性的细微特征和资源传输与分配的差异,同时也可以为形态可塑性成因提供合理的生理生态学解释。本文对温室内、外两种环境条件下生长的结缕草克隆植株的复合节间组分进行测定和分析,结果表明：温室内、外植株主匍匐茎的长度和生物量的波动比一级分枝大,缩短节间长度比伸长节间长度稳定,但缩短节间生物量较伸长节间生物量变化幅度大。伸长、缩短节间长度、生物量分别与复合节序数呈二次函数关系。伸长、缩短节间生物量和分株生物量在一个生长季的生长方程亦均呈二次函数关系。主匍匐茎根数量、生物量随复合节数递增基本呈递增趋势。在两种环境下,A分株根数、生物量均大于B分株根数、生物量（在结缕草匍匐茎上,着生于每个复合节的基端和梢端缩短节间上的分株分别称为A、B分株）,且差异明显。温室内植株,在分株发育形成后,伸长、缩短节间的长度、生物量分别与匍匐茎根、A分株根数、B分株根数、生物量间相关性显著,温室外的相关性格局较复杂,且总体显著性低于温室内。结缕草克隆植株基本形态结构单元的复合节上的各个组成部分之间存在的密切相关关系,是导致结缕草克隆植物形成形态可塑性的细微特征格局的主要原因。     

水稻花药特异表达启动子的克隆与活性检测

植物雄性器官特异表达启动子的克隆是作物杂种优势利用分子育种的基础.根据水稻花药特异表达RA8基因序列设计引物,从水稻(Oryza sativa L.)品种日本晴中克隆得到水稻花药特异表达基因RA8启动子Tsp2,该启动子为RA8基因翻译起始位点上游828 bp的片段,具有启动子特征序列TATA盒TATAAATA和真核生物启动子特征序列CAAT框,与RA8启动子的核苷酸序列同源性为97%.利用该启动子与报告基因GFP构建植物表达载体p1304-rap,采用基因枪法转化烟草花药,通过GFP的瞬时表达证明该启动子具有花药特异启动子活性. 图5 参9     

内循环半短程亚硝化工艺运行条件与微生物群落研究

在内循环半短程亚硝化工艺中,污泥浓度为4 000 mg·L-1、溶解氧小于0.2 mg·L-1、温度(15~29℃)、水力停留时间4.6 h条件下,不同的回流比对系统中微生物群落有着明显的影响,回流比75%时,微生物的生物量达到最高值,出水中的亚硝态氮和氨氮的浓度比可控制在1.定量PCR和16S rRNA基因的克隆文库结果表明:在低溶解氧浓度下氨氧化菌是主要脱氮菌群,该菌群促进了半短程亚硝化反应的进行,与传统的硝化系统比较,在内循环半短程亚硝化工艺中没有检测到硝化螺旋菌(Nitrospira)和硝化杆菌(Nitrobacter),在内循环半短程亚硝化系统中浮霉菌属(Planctomycetes)的量也高于传统的脱氮系统.氨单加氧酶基因克隆文库结果表明,系统中的氨氧化菌群主要属于亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas).因此内循环半短程亚硝化工艺在经济和技术上是可行的.     

海洋沉积物中硫酸盐还原菌和硫氧化菌群落分析方法的比较

硫酸盐还原菌(sulfate-reducing prokaryotes,SRP)和硫氧化菌(sulfur-oxidizing prokaryotes,SOP)在硫的生物地球化学循环中发挥着极为重要的作用.本文以SRP作为高丰富度高多样性菌群代表,针对于SRP所共有的异化型亚硫酸盐还原酶(dissimilatory sulphite reductase,DSR)中的β亚基基因(dsr B),通过克隆文库技术、454高通量测序技术和Illumina高通量测序技术对其群落特征进行比较分析.结果表明,Illumina高通量测序技术优于454高通量测序技术和克隆文库技术,特别在低丰度物种的检测方面,Illumina高通量测序技术具有明显优势.以SOP soxB基因(~750 bp)作为较长基因片段的代表,分别采用454高通量测序技术和Illumina单端高通量测序技术对SOP群落组成和多样性信息进行比较分析,结果表明,454高通量测序技术在读长上的优势并未体现出来,而Illumina单端高通量测序技术优于454高通量测序技术.     

再生水补水对河道底泥细菌群落组成与功能的影响

以北京市永定河麻峪湿地再生水补水河段河道底泥细菌群落为研究对象,联合限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术,16S rRNA基因克隆文库技术和实时荧光定量q PCR技术,分析再生水补水口上游、补水口及补水口下游这3个断面的细菌群落组成与功能特征差异,尝试解释再生水补水对河道底泥细菌群落组成和功能特征的影响.结果表明,再生水中高浓度的碳氮磷含量是导致补水口细菌群落多样性显著升高和群落组成最为丰富的直接原因,人工湿地对碳氮磷浓度有较高的去除效率,净化后底泥细菌群落逐步恢复,表现出上下游相似的细菌群落多样性和结构组成;补水口处细菌群落的优势类群是变形菌门中β-Proteobacteria和δ-Proteobacteria,亚优势类群是Planctomycetes和Actinobacteria,而ε-Proteobacteria、Chloroflexi、Spirochaetes是补水口处的独有类群;氮碳磷循环是再生水补水河道底泥主要的生物地化循环过程,克隆文库中补水口以毛单胞菌属(Comamonas sp.)为优势类群的45.9%的克隆子与氮循环相关,其相对丰度高于上下游(27.7%和23.4%),以溶杆菌属(Lysobacter sp.)为优势类群的17.9%的克隆子与碳循环密切相关,其相对丰度高于上下游(14.4%和12.9%);再生水中携带的痕量病原菌和抗生素等,在一定程度上改变了河道底泥细菌群落碳氮循环的转换方式,表现为补水口处固氮作用主要是红环菌属(Rhodocyclus sp.)通过光合作用实现,上下游以对植物具有促生作用的伯克氏菌属(Burkholderia sp.)为代表进行共生固氮.该研究结果为再生水补水河道人工湿地修复研究提供理论依据.     

海马齿小热激蛋白SpHSP18.1基因的克隆及盐胁迫表达分析北大核心CSCD

为探究海马齿高盐环境耐受性的分子机制,根据海马齿c DNA文库序列设计引物,采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术克隆得到海马齿小分子热激蛋白Sp Hsp18.1基因序列.Blast分析表明,该c DNA序列(968 bp)含完整开放阅读框(ORF)全长为489 bp,编码162个氨基酸.等电点(p I)为6.19,分子量(Mr)大小为1860 5.90.Sp HSP18.1编码氨基酸序列具有分子伴侣蛋白特有的ACD保守区域(Alpha crystallin domain),与拟南芥、西瓜等植物的细胞质I型小热激蛋白具较高同源性(>75%).将Sp Hsp18.1基因克隆到PUCm-T原核表达载体上,得到重组菌株,通过过量表达探究其耐热胁迫能力.结果表明,在37℃下重组菌株与野生型菌株的生长曲线基本相似,但在高温(45℃)下,重组菌株较对照组菌株存活率有显著提高.荧光实时定量PCR分析表明,在不同浓度海水培养条件下,海马齿根部均表达Sp Hsp18.1基因,且随着海水浓度的增加,该基因的表达量呈现上升的趋势.说明Sp Hsp18.1基因在海马齿应答高盐胁迫过程中起到一定的作用.     

贫营养条件下2种MBR污泥微生物的菌群对比

为了揭示贫营养环境下MBR污泥微生物群落结构的演替和菌群变化的异同,取洗浴再生水、工业再生水MBR的污泥进行周期培养,利用PCR-DGGE和克隆测序技术获得了DNA指纹图谱并建立系统发育树。研究表明,微生物群落结构在贫营养条件下演替明显,洗浴水污泥微生物形成新的优势菌群(Uncultured Pseudomonas)而工业水只维持了原有的部分菌群(Uncultured Sphaerotilus)。2种污泥培养过程中种群多样性变化突出且差异显著。同时洗浴水污泥菌群相似性在培养第8天时发生突变而工业水总体变化平缓。克隆测序表明2种MBR污泥中既有与贫营养环境适生的共性种属又有与各自来源相对应的特性种属。菌群特异性与废水来源紧密相关,是造成2种污泥对贫营养环境适应能力不同的根本原因。     

失去记忆性贝毒ASP酶联免疫检测方法的研究

建立了赤潮毒素失去记忆性贝毒中主要成分软骨藻酸(domoic acid,DA)的竞争酶联免疫检测方法.通过将DA偶联到蛋白载体上,免疫BALB/c小鼠,免疫数次后,得到抗DA的多克隆抗血清,以DA-OVA为包被抗原,利用抗原抗体反应,建立间接竞争酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)分析检测海水样品和海洋贝类中的赤潮毒素失去记忆性贝毒DA的方法.结果表明,该方法最低检出限10μg/L,海水样品平均回收率102.%,批内变异系数12.%;贝类样品平均回收率为111.%,批内变异系数4.8%.