摇蚊乙酰胆碱酯酶最佳反应体系的建立及有机磷类药剂敏感度比较

花翅摇蚊(Chironomus kiiensis)是一种重要的水生昆虫,经常用于水体环境质量的生物学评价.用正交试验方法研究了酶浓度、底物浓度、反应体系pH值、反应温度、反应时间5个因素对花翅摇蚊(Chironomus kiiensis)乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定的影响.通过对正交试验结果进行极差和方差分析,明确了测定摇蚊AChE活性的最适反应条件是酶浓度为5头/mL、底物浓度为6 mmol/L、pH值为8.0、温度为35℃、反应时间为10 min.DDVP、马拉硫磷和甲胺磷对花翅摇蚊的LC50值分别为8.93 mg/L、16.74 mg/L和47.65 mg/L.利用正交试验得到的反应最适条件进一步研究了花翅摇蚊接触上述3种药剂亚致死剂量后对其体内AChE活性的影响.结果表明,无论是时间效应还是剂量效应,3种药剂对花翅摇蚊幼虫体内AChE影响的趋势与生物测定结果是一致的,其对花翅摇蚊幼虫体内AChE的抑制能力依次为DDVP、马拉硫磷和甲胺磷.     

黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立

阿魏酸酯酶是参与半纤维素降解的重要酶类. 为了提高阿魏酸酯酶的活性和其它性能,本文作者采用RT-PCR技术从黑曲霉CIB 423.1中克隆了编码阿魏酸酯酶A的cDNA,构建了外泌表达的质粒,并将其转化到毕赤酵母GS115进行表达. 通过检测培养液上清中的酶活,表明阿魏酸酯酶已成功在这一体系表达. 同时,本文还建立了快速、稳定的酶活检测体系,为后续对阿魏酸酯酶酶突变体活性进行高通量筛选奠定了基础. 图5 参17     

测定化学物对乙酰胆碱酯酶抑制毒性的微板吸光法研究

随着化学污染物种类与数量的日益增多,高通量测试方法显得越来越重要。基于乙酰胆碱酯酶(ACh E)抑制法原理,以多功能酶标仪为测试设备,96孔微板为暴露反应载体,建立了测定化学物对ACh E抑制毒性的微板吸光法。系统研究了ACh E浓度、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)浓度、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)浓度对显色吸光度、吸光度变化速率、化学物测试毒性的影响。结果表明,随着ACh E、DTNB、ATCI的浓度增加,吸光度均增加;吸光度变化速率与ACh E浓度呈正相关,与DTNB浓度基本无关,与ATCI浓度呈现先增后减的双相关系;随着ATCI浓度增加,灭多威剂量-效应曲线(DRC)向右移动。最终建立的优化测试条件为DTNB 0.2 g·L~(-1)、ATCI 0.2 g·L~(-1)、ACh E 0.04 U·m L~(-1)、p H 6.8、反应温度29℃及暴露时间15 min;并与国标方法进行了对比与验证,发现试剂加样顺序对毒性测定结果有显著影响。基于ACh E的微板毒性测试结果表明,灭多威的DRC呈现良好的S型曲线,可用Weibull函数有效表征,拟合决定系数R2大于0.97,空白变异控制在了±10%以内。此方法可用于化学污染物的高通量毒性检测。     

蔬菜中有机磷农药残留的生物传感器法检测

将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定在醋酸纤维膜上,将该膜组装在一支pH玻璃电极敏感膜表面,制成用于测定有机磷农药的电位型生物传感器,优化其制备方法。当溶液中存在有机磷农药,酶的活性受到抑制,酶活性的降低引起pH玻璃电极电位的改变,其改变程度与溶液中农药的浓度大小有关。用本文方法测定了蔬菜中的对硫磷、辛硫磷、氧乐果、敌敌畏,结果满意。     

氯酚与乙酰胆碱酯酶相互作用的光谱研究

采用荧光光谱法和紫外-可见光谱法研究了2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)及五氯酚(PCP)与乙酰胆碱酯酶(AChE)的相互作用,获得了相互作用的Stern-Volmer猝灭常数、结合常数、热力学参数和作用距离.结果表明, 2,4,6-TCP及PCP均可以使AChE内源荧光有规律地猝灭,温度小于303K时,其猝灭机制为静态猝灭. 2,4,6-TCP及PCP与AChE的结合过程是受熵驱动的自发过程,作用力为典型的疏水作用力. 2,4,6-TCP及PCP与AChE分子中酪氨酸残基的作用距离分别为1.91,2.00nm, 2,4,6-TCP及PCP与AChE分子的结合常数为104~105L/mol,表明2种氯酚与AChE之间发生了非辐射能量转移,两者形成了稳定的复合物.2,4,6-TCP与AChE的结合作用比PCP与AChE的结合作用强,氯酚分子向AChE分子疏水空腔的结合过程是疏水性效应和空间位阻效应彼此竞争的结果.     

用于有机磷农药残留检测酯酶的筛选

利用农药对酯酶活力的抑制反应,测定了不同浓度的敌敌畏对游离的不同动物肝脏酯酶的酶活性。实验采用从动物肝脏中提取的粗酶液在水解后与显色剂固兰B盐作用,用分光光度计测定其在595nm处的吸光度。结果表明,猪肝中α-乙酸萘酯酶(α-NA Esterase)的活力较高,且对较低浓度的敌敌畏也有较好的灵敏度。鸡肝和鸭肝α-乙酸萘酯酶对敌敌畏浓度变化不是很明显。     

乙酰胆碱酯酶和发光菌检测有机磷农药毒性研究

有机磷农药(organophosphoms pesticides,OPs)污染形势严峻.研究采用乙酰胆碱酯酶(acety|cholinestersse,AChE)和T<,3>发光菌2种生物检测法,在急性毒性实验基础上,研究了几种有机磷农药的联合毒性,为今后OPs检测标准的制定提供参考.实验结果表明,在最佳反应条件下,A...     

Assessment of air pollution genotoxicity by RAPD in Evernia prunastri L. Ach. from around iron-steel factory in Karab¨uk, Turkey

Lichens are widely used in biomonitoring studies of air pollution, either as bioindicators of air quality or as bioaccumulators of atmospheric deposition. Over the past decade, several molecular techniques have been developed to provide information on diversity, genotoxicology, genetic relationships, etc. The heavy metal contents of Evernia prunastri samples were determined by atomic absorption spectrometry. The Random Amplified Polymorphic DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) method was used to describe the pattern of DNA band variation in the samples influenced by the environmental pollution. The study was designed to describe the level of pollution in an area contaminated with smoke and waste from an iron-steel factory, and to reveal the level of potential genotoxic agents around this source of pollution. The study also examined the suitability of the lichen samples for the detection of genotoxicity.     

应用流式细胞分析技术研究溴氯海因对近头状伪蹄形藻的毒性作用

实验采用流式细胞术的检测分析方法,探究溴氯海因(BCDMH)对常见淡水藻类近头状伪蹄形藻的作用.研究结果显示BCDMH对近头状伪蹄形藻钓生长抑制作用呈明显的浓度依赖型变化.根据不同浓度细胞生长抑制的百分率计算,24、48和72 h BCDMH对近头状伪蹄形藻生长抑制作用的EC50分别为3.64、3.21和2.56 mg...     

外源硫酸盐介入下沉积物磷释放、解磷微生物及磷酸酶活性的变化

人类生产活动导致湖泊水体硫酸盐浓度日益增加,硫酸盐与沉积物中磷之间的关系引起关注.该研究以武汉东湖水和沉积物为研究对象进行实验室模拟,研究为期近一年且温度变化的条件下外源硫酸盐对沉积物释磷及微生物的作用.结果表明,硫酸盐输入使沉积物pH和氧化还原电位(E h)总体呈降低趋势.外源硫酸盐促进了沉积物磷的释放,输入硫酸盐(S500)与对照(CK)之间的上覆水存在显著差异(p0.01),S500的上覆水中总磷浓度最高值达0.33 mg·L-1,为对照的2倍.湖泊沉积物中有机磷解磷菌的数量高于无机磷解磷菌,上层沉积物解磷菌的数量和沉积物总磷的含量之间呈负相关.S500的沉积物中磷酸二酯酶活性高于磷酸单酯酶活性,且不同分层沉积物磷酸单酯酶活性和磷酸二酯酶活性之间的正相关性达到显著水平.温度升高,磷酸酶的活性逐渐增强,促使沉积物内源磷释放量增加.