测定环境污染物对青海弧菌发光强度抑制的微板发光法研究

以新型淡水发光菌——青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensissp.—Q67)为检测生物,以VeritasTM微孔板光度计为发光强度测试设备,建立了测定环境污染物对发光菌发光强度抑制毒性的微板发光测试新方法.系统地研究了pH值、菌密度、反应时间等实验条件对发光强度的影响.应用该方法成功地测定了7种取代酚环境污染物对Q67的发光抑制毒性效应.提出应用非线性迭代最小二乘拟合法模拟环境污染物对Q67毒性的剂量-效应曲线(DRC),拟合效应与实验结果之间的相关系数均大于0.99.通过拟合的DRC参数,准确地计算了污染物的半数效应浓度EC50.对比有关文献方法,微板发光法具有更简便快捷,节省试剂药品,便于多次平行测定从而提高准确度等优点.     

通用浓度加和模型预测有机磷与三嗪农药对绿藻的联合毒性

基于微板藻毒性试验测定5个有机磷农药与4个三嗪类农药的单个及联合毒性.根据半数效应浓度(EC50),对斜生栅藻96h生长抑制的毒性大小顺序为:西草净>阿特拉津>扑灭通>苯嗪草酮>草甘膦>敌敌畏>磷胺>乙酰甲胺磷>甲胺磷.这表明直接干扰光合作用电子传输的三嗪除草剂的藻毒性明显大于有机磷农药.以通用浓度加和作为参考模型,三嗪类农药按EC50和EC10(10%效应浓度)浓度比的混合物对斜生栅藻呈现加和毒性.有机磷农药按EC50和EC10浓度比的混合物在低浓度呈现加和毒性,在高浓度呈现协同毒性.有机磷与三嗪类农药按EC50和EC10浓度比的混合物在低浓度为加和毒性,在高浓度为协同毒性.     

部分除草剂与重金属混合物对发光菌的毒性

以5种不同类型除草剂和4种重金属为混合物组分,探索混合物毒性变化规律.应用微板毒性分析方法,测定了百草敌、磺草灵、西草净、除草定、环嗪酮、CdCl2·2.5H2O、Ni(NO3)2·6H2O、CoSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O对淡水发光菌—青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp.—Q67)的发光抑制毒性.应用非线性最小二乘拟合技术模拟实验剂量-效应数据.结果表明,5种除草剂与4种重金属化合物的剂量-效应曲线(DRC)均可用Weibull函数有效表征.为了全面考察各种不同浓度组成的混合物对Q67的毒性,设计了9个组分同时存在的3个等效应浓度比(EECR)混合物和10个均匀设计浓度比(UDCR)混合物.同样应用微板毒性分析方法测定了各个混合物对Q67的抑制毒性,并应用非线性最小二乘拟合技术模拟了其剂量-效应曲线.通过剂量加和(DA)与独立作用(IA)模型综合分析了各个混合物对发光菌的毒性变化规律.结果表明,不同类型除草剂与多种重金属的各种浓度组合的混合物毒性均可用DA模型进行预测和评估.     

均分等效面设计法的建立及其用于三组分混合物等效面的构建

等效线与等效面在化学混合物毒性相互作用评价方面具有综合、直观、有效等特点。但目前等效面尚无有效的绘制方法,主要原因是三元混合物组分浓度配比缺乏有效、直观的试验设计方法。根据三组分混合物等效面的三角形特征,提出了一种新的均分等效面设计(EESD)方法用于三元组分浓度配比试验设计。最终,得到了组分的9个毒性单位(EC50)比,分别是1:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1。按照惯例还增加一个毒性单位比1:1:1的等毒性浓度比混合物射线。组分两两混合按照直接均分射线法进行毒性单位比1:5、2:4、3:3、4:2、5:1设计15个二元混合物射线。单个组分在浓度轴上的3个ECx点构成了等效面的3个顶点。这28个等效点采用基于三角形的3次插值得到混合物x%效应的观测等效面。基于EESD构建了[BMIM]BF4、灭多威、敌敌畏的混合物对乙酰胆碱酯酶抑制效应为80%、50%、20%的等效面。等效面分析表明,除了1:1:7混合物射线在80%与50%效应时为拮抗作用外,三元混合物体系总体上为加和作用。同时给出了三元混合物EESD方法设计的一般规则。EESD方法可有效用于三元组分的浓度配比优化设计与三维等效面的绘制。     

三氯生对青海弧菌Q67和人乳腺癌细胞MCF-7的时间毒性

三氯生(triclosan,TCS)是一种广谱性抗菌剂,2005年欧盟水框架指令将TCS列为一种新型污染物。目前对TCS的研究局限于急性毒性实验,关于TCS毒性随时间的变化以及不同溶解状态下TCS的毒性差异的研究却鲜有报道。应用以96孔微板为暴露反应载体的微板毒性分析法,添加氢氧化钠(NaOH)或使用二甲亚砜(DMSO)作为助溶剂溶解TCS,分别测定其对青海弧菌Q67的相对发光抑制毒性(15min急性毒性和时间毒性)和对人乳腺癌细胞MCF-7在不同暴露时间(24、48和72h)内的细胞增殖抑制毒性。Q67的急性毒性实验结果表明,碱性条件下TCS的毒性(EC50=3.97(10-8mol.L-1)大于DMSO作为助溶剂时的毒性(EC50=1.68(10-4mol.L-1)。无论碱性条件还是DMSO助溶,TCS在不同暴露时间内对Q67的时间毒性没有明显差异。在不同暴露时间下MCF-7增殖抑制率实验中,DMSO作为助溶剂时,TCS的最高实验浓度为1.46(10-3mol.L-1,随着暴露时间的延长,抑制率在24、48和72h时分别为27.8%、44.2%和62.4%;碱性环境时TCS的最高实验浓度为1.39(10-6mol.L-1,随着暴露时间的延长,抑制率在24、48和72h时分别为20.2%、55.8%和73.9%。研究表明,在DMSO和NaOH作为助溶剂的条件下,TCS对MCF-7均存在时间毒性差异,并且NaOH碱性溶液中TCS对MCF-7的毒性远大于DMSO作为助溶剂时的毒性。     

微板吸光法测定9种农药对斜生栅藻的抑制毒性

以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)为指示生物,96微孔板为暴露反应载体,SpectraMax M5酶标仪为吸光度测试设备,建立了测定毒物对藻生长抑制毒性的微板吸光法.论文系统研究了微板吸光法中斜生栅藻的可见吸收光谱和生长曲线以及pH和暴露时间对藻生长的影响,同时应用该方法成功测定了环嗪酮、阿特拉津、西草净、扑灭通、苯嗪草酮、敌草快、草甘膦7种除草剂和磷胺、甲胺磷2种杀虫剂对斜生栅藻的剂量-效应曲线(DRC).通过对剂量-效应数据进行非线性最小二乘模拟,获得了这些农药的半数效应浓度EC50及置信区间.对比标准锥形瓶栅藻毒性试验,微板吸光法具有测试简便快速,所需样品体积少,便于多次平行毒性测试等优点.     

中心复合设计射线法考察离子液体C16H31ClN2与乐果的毒性相互作用

离子液体(ILs)是一种用于替代传统易挥发有机溶剂的新型"绿色"溶剂.由于不挥发、不会对大气产生污染而得到广泛应用.但是某些ILs易溶于水,其自身毒性能够对生态环境造成潜在影响,这已引起诸多学者对ILs毒性的研究兴趣.然而ILs与其它污染物的毒性相互作用目前研究很少.论文选取咪唑类离子液体C16H31ClN(2DMI)与有机磷杀虫剂乐果(DIM)作为目标化合物,以青海弧菌Q67为检测生物,采用微板毒性分析法测定了目标化合物及其混合物的毒性.为全面考察不同浓度范围DMI与DIM的毒性相互作用,将中心复合设计与固定浓度比射线法有机结合起来构建5个不同浓度比的混合物射线,通过浓度加和与独立作用模型对混合物射线进行比较评估.结果表明在DMI浓度较大且DIM浓度较低时,DMI与DIM之间存在明显拮抗作用,而在其它浓度范围内两者之间为加和作用.     

测定化学物对乙酰胆碱酯酶抑制毒性的微板吸光法研究

随着化学污染物种类与数量的日益增多,高通量测试方法显得越来越重要。基于乙酰胆碱酯酶(ACh E)抑制法原理,以多功能酶标仪为测试设备,96孔微板为暴露反应载体,建立了测定化学物对ACh E抑制毒性的微板吸光法。系统研究了ACh E浓度、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)浓度、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)浓度对显色吸光度、吸光度变化速率、化学物测试毒性的影响。结果表明,随着ACh E、DTNB、ATCI的浓度增加,吸光度均增加;吸光度变化速率与ACh E浓度呈正相关,与DTNB浓度基本无关,与ATCI浓度呈现先增后减的双相关系;随着ATCI浓度增加,灭多威剂量-效应曲线(DRC)向右移动。最终建立的优化测试条件为DTNB 0.2 g·L~(-1)、ATCI 0.2 g·L~(-1)、ACh E 0.04 U·m L~(-1)、p H 6.8、反应温度29℃及暴露时间15 min;并与国标方法进行了对比与验证,发现试剂加样顺序对毒性测定结果有显著影响。基于ACh E的微板毒性测试结果表明,灭多威的DRC呈现良好的S型曲线,可用Weibull函数有效表征,拟合决定系数R2大于0.97,空白变异控制在了±10%以内。此方法可用于化学污染物的高通量毒性检测。     

剂量-效应关系两种置信区间的比较

毒性实验存在随机误差,同时剂量-效应曲线(DRC)拟合也会产生误差.因此,合理表征剂量-效应关系及其置信区间非常重要.本研究在剂量-效应曲线非线性拟合基础上,阐述了构建拟合函数置信区间(FCI)与实验观测置信区间(OCI)的基本原理.并以对氯苯酚及等效应浓度比混合物为例,说明目前多数文献使用的FCI不能有效地描述真实毒性实验的不确定度,提出以OCI表征DRC,以求真实反映观测毒性效应的不确定度.利用剂量加和与独立作用模型预测了混合物毒性,并与OCI比较,得到混合物毒性作用类型.建议在分析混合物协同、拮抗、独立与加和作用时,应充分考虑OCI.     

多组分苯胺类混合物对发光菌的抑制毒性

以淡水发光菌——青海弧菌(Q67)为指示生物,96微孔板为实验反应载体,微板光度计为发光强度测试设备,测定了苯胺、邻甲基苯胺、对甲基苯胺、邻硝基苯胺、对硝基苯胺及其混合物对发光菌的发光抑制毒性,应用非线性最小二乘拟合技术与剂量加和(DA)及独立作用(IA)原理研究了混合物的毒性规律.1)分别测定每种化合物的剂量-效应数据并进行非线性拟合.结果表明,5种苯胺类化合物的剂量-效应曲线(DRC)均可用Logit与Weibull函数有效表征,从这些模型估算的半数效应浓度负对数值(-logEC50)分别为2.11、2.35、2.49、3.60和3.88(EC50单位:mol·L-1),可知其对发光菌的毒性大小顺序为:苯胺<邻甲基苯胺<对甲基苯胺<邻硝基苯胺<对硝基苯胺.2)根据组分EC50、EC10和EC1设计3个等效应浓度比混合物进行混合物毒性实验,并对混合物剂量-效应数据进行非线性拟合得到混合物DRC.结果表明,混合物DRC可用Box-Cox-Logit与Box-Cox-Weibull函数有效表征.3)根据单一化合物DRC模型,分别应用剂量加和(DA)与独立作用(IA)模型对混合物DRC进行预测.结果表明,无论考察混合浓度比例还是效应水平,剂量加和模型都能准确预测苯胺类混合物的毒性,而独立作用模型倾向于高估混合物毒性.