慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体的构建及其特性

通过转座子Tn5诱变和同源重组，构建了Bradyrhizobium japonicum USDA110聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体．序列测定确定了转座子插入的精确位置，所获得的4个转座子诱变的质粒其Tn5插在phbC基因内两个相距仅9bp的位点．被Southern和PCR证实的突变体菌株仍能产生相当于野生型菌株12．97％—25．10％的PHB，并且在突变体和野生型菌株总DNA杂交图上都呈现出一条约5kb的阳性带，推测在B.japonicum基因组中存在不止一个聚羟丁酸合成酶基因．图3表4参17     

费氏中华根瘤菌lrp基因的克隆、突变与功能

通过分子克隆技术,从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因组文库中克降到一个lrp基因.该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021的lrp基因在核苷酸水平上有89%相似性,在氨基酸水平上有99%相似性.利用自杀质粒pK18mob构建含有lrp基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株HN01中,经过同源单交换,获得发生正向插入突变的突变株GXHNLTA和反向插入突变的突变株GXHNLTB.将lrp基因ORF连接到载体pLAFR3上,获得用于互补的质粒pGXHNL100,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补株GXHNWA、GXHNWB.对野生型菌株、突变株、互补株进一步研究发现,在以脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸等氨基酸为唯一碳、氮源的MM培养基中培养时,突变体GXHNLTA、GXHNLTB的生长均滞后于出发菌株HN01.植株试验表明,突变菌株GXHNLTA、GXHNLB比野生菌株HN01开始结瘤的时间提前1 d,在结瘤效率、单株瘤数、瘤重、固氮酶活性方面并无显著差别.     

青岛市不同功能区降雨径流重金属的特性分析

通过采集2014年9月28日青岛市4个不同功能区降雨径流样品,监测其重金属Cd、Cu、Pb、Zn的含量,并分析重金属之间的相关性、事件平均浓度(EMC)和初期冲刷现象等。结果表明:石油化工区降雨径流中Cd、Cu、Pb之间具有显著相关性,并且Zn、Cu、Pb之间亦具有显著相关性;重金属Cd、Pb是降雨径流中主要污染物,Pb具有交通强度越高含量越高的特点,Cd具有距离石油化工区越远含量越低的特点;降雨径流中Cd、Cu、Pb、Zn的初期冲刷效应不仅与汇水面积、下垫面材料有关,而且与重金属的类别有关。     

费氏中华根瘤菌ntrBC基因突变株的构建及其特性

从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因文库的重组质粒pGXHN300上获得ntrB、ntrC基因完整序列.通过自杀质粒pK18mob同源单交换的方法,分别获得了HN01菌株的ntrB和ntrC基因的突变株GXHNB、GXHNC.功能检测证明GXHNB、GXHNC能以硝酸盐为唯一氮源进行正常生长,但不能以铵源作为唯一氮源进行正常生长.图4表2参15     

不同根瘤菌中突变cysDN基因对硫酸盐同化途径的影响

硫是生物体必须的元素,根瘤菌结瘤因子的硫化修饰与其宿主范围和识别效率有着重要关系,实验室前期研究中突变费氏中华根瘤菌的cys DN基因后,突变体不能利用硫酸盐生长,这与Sinorhizobium sp.BR816的cys D基因突变后的现象不同,两株菌的硫酸盐同化途径中可能存在差异.为探讨不同根瘤菌cys DN基因对硫酸盐同化途径的影响,本研究利用同源交换的方法构建费氏中华根瘤菌WGF03、费氏中华根瘤菌HN01、苜蓿中华根瘤菌14500及大豆慢生根瘤菌15606的cys DN突变体,Δcys DN-WGF03、Δcys DN-HN01、Δcys DN-14500和cys NR-15606,对突变体的硫源利用情况和植株结瘤情况进行研究.结果发现,Δcys DN-WGF03和Δcys DN-HN01失去利用硫酸盐的能力;Δcys DN-14500能微弱地利用硫酸盐生长,生长量约为野生菌株的1/3左右;cys NR-15606对硫酸盐的利用与野生菌株相比无明显差别.植株实验结果显示,Δcys DN-WGF03、Δcys DN-HN01和Δcys DN-14500在平均瘤数、平均瘤重、平均植株干重和固氮酶活性方面均表现出显著降低,而突变体的回补体能够恢复硫酸盐的利用能力及与植株的共生固氮能力.这说明cys DN基因在费氏中华根瘤菌WGF03、费氏中华根瘤菌HN01和苜蓿中华根瘤菌14500硫酸盐同化途径中起着关键影响,而该基因在大豆慢生根瘤菌15606的影响并不明显.本研究表明,cys DN基因在不同根瘤菌中所起的作用不同,不同根瘤菌的硫酸盐同化方式也存在差异.     

慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)的克隆和序列测定

以苜蓿根瘤菌Rm1021的phaC基因突变体菌株Rm11144 (phaCTn5-233)为受体菌,通过功能互补,成功地从构建的Bradyrhizobium japonicum USDA110基因文库中,筛查到能与Rm11144互补,使之恢复在以乙酰乙酸为唯一碳源的M9培养基(M9-AA)平板上5 d形成明显可见菌落,以及在MOPS平板上形成粘液型菌落的表型的重组粘粒pDC2; 经证实,该粘粒带有phbC基因.完成了该基因的全序列测定并已在GenBank登记,登记号为AY077580.B.japonicum phbC基因由1803碱基对组成,GC含量61.8%,AT含量38.2%;编码600个氨基酸,Mr=66.95×103. 图3 表3 参13     

费氏中华根瘤菌15142的cysDN基因克隆及其相关功能

为确定cysDN操纵子的功能及对根瘤菌结瘤的影响,通过三亲本接合,将质粒转座子pTnMod-RKm′随机插入费氏中华根瘤菌15142中,建成随机插入突变体库,随后通过含有不同硫源的MM培养基的筛选得到一株不能利用硫酸盐但能够利用半胱氨酸的突变体.进一步克隆和测序分析后发现该操纵子与已报道的Sinorhizobium sp.strain BR816的cysDN在核苷酸水平上有92%的相似性,在氨基酸水平上有96%的相似性.用自杀质粒pK18mob分别构建含有cysD部分片段和cysN部分片段的重组质粒,通过三亲本接合导入出发菌株15142中,经过同源单交换,分别获得cysD的pK18mob正反向插入突变株cysDF/15142以及cysDR/15142和cysN的pK18mob正反向插入突变株cysNF/15142与cysNR/15142.用广谱宿主质粒pLAFRJ载体连接完整操纵子cysDN构建互补质粒cysDN+pLAFRJ,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补菌株.用不同硫源的液体MM培养基培养,发现互补菌株能够补回突变菌株不能利用硫酸盐作为唯一硫源的缺陷,说明cysDN操纵子确实与硫酸盐同化途径有关;植株试验表明突变株比出发菌株推迟结瘤1~2 d,固氮酶活也比出发菌株稍低;竞争结瘤试验表明突变菌株占瘤率较差,但在平均瘤数、平均瘤重、平均植株干重上则无差异.