活性污泥高质量RNA快速提取方法研究

通过比较RNA产量、纯度、降解程度、特定基因的扩增能力、微生物多样性等评价指标,考察和探讨了5种不同RNA提取方法对活性污泥总RNA提取效果的影响并最终建立了一种快速、有效的活性污泥RNA提取方法,即在TENP和PBS洗涤沉淀污泥的基础上,分别采用溶菌酶和TRIzol裂解活性污泥细菌、氯仿去除细菌裂解液中的蛋白和大部分DNA、异丙醇沉淀核酸和DNase I水解残留DNA后,最后进一步用离心柱纯化RNA.结果表明,这种方法可以有效提取高质量的菌群RNA,不仅提取的RNA总量多(每g污泥可提取169.6μg RNA)、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富的生物多样性,而且可同时进行16SrRNA和amoA基因的RT-PCR扩增反应;与其它方法相比,性价比高,具有明显的优越性,适用于活性污泥RNA的大量提取,同时,T-RFLP结果证明RNA提取方法对分析样品的微生物种类和丰度分析结果影响较大,不同的RNA提取方法所获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同.本研究建立了一种快速、有效的高质量RNA提取方法,将在监测活性污泥菌群动态变化、菌群代谢功能学、微生物群落芯片等研究上具有重要意义.     

一种新的好氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现

利用间歇曝气富集,氰化钾(KCN)选择培养基筛选好氧反硝化的细菌,通过形态学特征、生理生化反应及16SrDNA同源性比较对筛得菌株进行鉴定,并对其好氧反硝化相关基因napA进行扩增并测序比较.筛选到一株可以柠檬酸钠为碳源,硝酸钾为氮源,进行好氧反硝化的细菌.在溶解氧(DO)为(9.0±0.5)mg/L的培养基中,该菌株5 d内将硝态氮由282.0 mg L-1降解至149.2 mg L-1,其硝态氮去除率为46.47 ng mg-1min-1,同时亚硝态氮仅有少量的积累.经鉴定,初步判定它为假单胞菌属,命名为Pseudomonas sp.Y2-1-1.从其基因组中扩增出与好氧反硝化相关的周质硝酸盐还原酶(NAR)的亚基napA基因,并与已报道的napA基因进行Blast比较,发现具有较大差别.利用间歇曝气富集,氰化钾(KCN)选择培养基筛选好氧反硝化的细菌是非常有效的.初步认为Pseudomonas sp.Y2-1-1是一株新的好氧反硝化菌.图6表3参12     

一些硝化细菌的分离与鉴定

采用硝化细菌选择培养基从土壤、污水中筛选获得了 10株细菌 (X0 1～X10 ) ,经革兰氏染色及生理生化鉴定均为革兰氏阴性菌 ,呈杆状或球状 ,均能够利用亚硝酸盐 .电镜观察发现 ,这 10株细菌均具有比较复杂的细胞膜结构 ,与报道的硝化细菌所特有的膜结构相同 .对硝化细菌的特征性基因norB进行检测结果表明 ,所有菌株均可扩增出该基因 .初步判断所筛选的细菌为硝化细菌 ,依据《伯杰细菌鉴定手册》进行分类 ,主要为硝化杆菌、硝化球菌和硝化刺菌属等 .图 3表 4参 15     

环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。      

聚四氟乙烯复合膜材料的透湿性和生物防护性能研究

测试了聚四氟乙烯（PTFE）复合膜材料的透湿性和对氯化钠气溶胶、粉末状微生物枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC9372）、液体中脊髓灰质炎病毒疫苗株的防护性能。结果表明，该复合膜材料有良好的透湿性能，同时对氯化钠气溶胶、粉末状和液体中的微生物均具有良好的防护性能。     

白腐菌J-6对五类化学结构染料的脱色性能

从白腐菌中筛出了一株能对五类不同化学结构的染料进行高效脱色的菌株——J-6。通过采用“批式”摇床培养法，测定染料脱色率，从而确定该菌株能高效脱色的最佳培养时间和连续处理染料的能力。发酵培养96h的菌体可使活性艳蓝R(A)SP在5h内脱色率达95％以上；活性翠蓝G、活性黑GRP、混合染料在9h内脱色率达90％以上；孔雀绿、Po1yR-478在24h内脱色率分别达95％、90％以上。另外，J-6对不同染料最佳脱色时间和最终脱色效率与菌体本身发酵培养的时间长短和染料的种类紧密相关。J6处理能力强，连续处理4次染料后仍保持较高的脱色率。     

亚硝酸细菌amoA基因的克隆、测序与表达

采用PCR技术对亚硝酸细菌的特异性amoA基因进行克隆、测序 ,以确定其准确性 ;然后采用基因重组技术构建亚硝酸细菌的基因工程菌 ,并进行鉴定与功能初步评价 .结果表明 ,克隆得到的 4种亚硝酸细菌的amoA基因 ,与标准菌株Nitrosomonassp.GH2 2的amoA基因同源性达到 98%～ 99% ;构建了一种含有特异性amoA基因的大肠杆菌基因工程菌株 ,并采用直接比色法对重组细菌的氨氧化活性进行测定 ,发现基因工程菌的氧化氨氮速率明显高于分离的野生菌株 .研究表明 ,利用基因重组技术对亚硝酸细菌等自养菌进行改造 ,构建高效基因工程菌在水污染治理领域具有可行性 .图 6表 1参 12     

好氧异养硝化菌Acinetobacter sp.YY-5的分离鉴定及脱氮机理

通过异养硝化培养基获得一株高效脱氮细菌,并通过形态学特征、生理生化反应及16S rDNA同源性比较对筛得菌株进行了鉴定;分别以NO3--N和NO2--N为唯一氮源,通过对脱氮过程中各种含氮代谢物的定量及对脱氮相关基因氨单加氧酶基因(amoA)、羟胺氧化酶基因(hao)、周质硝酸盐还原酶亚基基因(napA)的扩增及测序比较,对该菌株的生理途径及脱氮机理进行了研究.结果表明,高效脱氮细菌YY-5不能发生好氧反硝化,但能在3 d内将氨氮由95.23 mg/L降解至1.29 mg/L,降解率达妻98.6%,同时未发现亚硝酸盐氮、硝酸盐氮积累;对该菌主要代谢气体产物进行检测,发现CO2和N2明显增多,无N2O生成;经鉴定,初步判定该菌为不动杆菌属,命名为Acinetobacter sp.YY-5;从该菌基因组中均能扩增出amoA、hao、napA等基因,其中napA与hao基因与已报道的napA与hao基因进行Blaster较,发现具有较大差别.图6表3参15     

CTX-M型产ESBLs耐药基因在城市典型河流中的生态分布

为了解流经我国城市的典型河流中CTX-M型耐药基因的分布情况及基因变异的多态性现状,进而为科学预防和避免抗生素耐药性的产生和传播提供生态学理论支持,采集我国东部6条典型河流流经城市区段的水样,采用宏基因组学技术与限制性酶切片段多态性分析(RFLP)技术相结合对质粒宏基因组PCR产物进行了分析,并将数据进行生态学统计处理.结果显示CTX-M三种亚型的基因群落在调查中的6条河流均有分布,且都保持了较高的均匀度(E≥0.9298),亚型1中分布于长江水体的基因群落具有明显高于其他河流和平均值的多样性(H’=2.4774)和物种优势度(D=0.9107),而亚型2、3的多样性和优势度最高值则均出现在黄河水体中;松花江与海河之间的群落相似性最高,达到0.806 2,而黄河与珠江基因群落之间的相异性则达到了0.580 0.说明在调查中采样的6条河流中均分布着结构稳定且基因优势突出的CTX-M型耐药基因,已对水体生态安全构成了隐患,需要结合进一步研究对其进行防治,以避免耐药基因以质粒为媒介向其他微生物传播造成抗生素耐药性扩散.     

直链烷基苯磺酸钠(LAS)降解菌的分离鉴定及其降解特性

从天津市某洗涤剂生产厂的排水沟污泥中分离到一株对直链烷基苯磺酸钠（LAS）具有较强降解能力的菌株LAS1，经生理、生化、VITEK微生物自动鉴定仪以及分子生物学等方法鉴定，该菌为放射形土壤杆菌（Agrobacter radiobacter），LAS1生长的最佳pH值为7．0，最适生长温度为30℃，无机氮可以促进其对LAS的降解，而有机氮则会对其降解LAS产生强烈竞争．当LAS浓度高于60mg／L时，LAS1的LAS降解能力受到一定程度的抑制．LAS1对LAS的降解时间动力学曲线为二级动力学反应．图4参5