几株紫色非硫细菌的分离鉴定与产氢特性分析

从重庆地区不同环境淤泥、泥水样品中,经富集培养、分离纯化,获得5株紫色非硫细菌.根据菌体的菌落形态、染色特性、生理生化特征及活细胞光吸收峰对菌株进行常规鉴定,结合菌株16S rDNA扩增测序进行分子生物学分析验证,构建了菌株与数据库中近缘菌株的系统发育树.以优化的培养条件(营养、pH、接种量等参数)对供试菌株的生理生化特性和产氢能力做了比较分析.结果显示,5个菌株均为光合产氢细菌,菌株ANI、D1为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),AN2、AS1、BS1等3株为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides);其中类球红细菌菌株AN2在给定的培养条件下光合产氢能力最高,可达9.55μg/mL d-1,是一株有应用前景的光合产氢细菌.图4表2参15     

产氢光合细菌的分离鉴定及高产氢菌株的筛选

利用特殊培养基从光照充裕、有机质含量高的污水沟、稻田淤泥中富集培养得到光合细菌优势菌种,采用梯度稀释法,通过双层固体平板进行分离和纯化,得到4株具有产氢性能的光合细菌菌株,按照<伯杰细菌鉴定手册>(第8版)关于光合细菌分类的方法进行生理生化特征鉴定,进行了16S rDNA的基因序列分析,并与NCBI上标准菌株基因序列进行比对,确定CQU-z、GLS-Z、CQK-Z、CJK-C的16S rDNA碱基长度分别为1 368 bp、1 453 bp、1 369 bp、1 432 bp,结果表明,这4株光合细菌菌株分别属于Rhodopseudomonas palustris和R.gelatinosa.同时通过光生物反应器进行产氢性能研究,表明光照条件为590 nm、6 000 lx时,菌种CQK-Z在连续62 h培养中总产氢量最高,为12.04mmol,相应的光化学效率和最大产氢速率分别为33.45%、1.84mmol L-1h-1.     

沼泽红假单胞菌高效产氢hupL缺失突变株的构建

利用湖底淤泥分离的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQU01作为出发菌株,构建吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株,以提高光合细菌菌株的产氢效率.以PCR扩增的hupL两侧hupS 和 hupC基因为同源重组双交换臂,连入pMD18-T载体;再将hupS, hupC 和Kmr基因与经SalⅠ和HindⅢ双酶切的pSUP202,构建靶向自杀载体pBPZ.经接合转移转化R. palustris CQU01菌株,成功获得沼泽红假单胞菌吸氢酶活性缺失突变株R. palustris CQU012.测定突变株的吸氢酶活性及生长和产氢特性,结果表明,突变株的产氢量比野生菌株提高了约50%,而生长特性与野生菌株没有显著差异.R. palustris CQU012 吸氢酶缺失突变株可望为工业废水的生物治理提供高效产氢工程菌株.     

沼泽红假单胞菌phbC-hupL双突变株构建及产氢测定

利用湖底淤泥分离的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQU01和该菌株的吸氢酶基因hupL缺失菌株CQU012作为出发菌株,分别构建聚羟基丁酸酯合成酶基因phbC单突变株及聚羟基丁酸酯合成酶基因phbC与吸氢酶基因hupL双突变株,以提高其在光照培养条件下的产氢量.以同源重组双交换方法构建含有Em抗性基因的自杀载体,通过接合转移转化R. palustris CQU01菌株,经PCR扩增以及测序验证,成功获得了沼泽红假单胞菌phbC单突变株R. palustris CQU013及phbC-hupL双突变株R. palustris CQU014.相同条件下测定突变菌株与野生菌株的生长和产氢特性,结果显示,突变菌株生长曲线与野生菌株有明显差异,两株突变菌株的产氢量分别是原始菌株的1.31和1.76倍,达到454mL/L和604mL/L.双突变菌株产氢能力较phbC基因和hupL基因单突变菌株的产氢能力有明显提高,说明phbC和hupL基因对菌株R. palustris 的产氢代谢有着显著的影响.