深海沉积物微生物宏基因组文库中IMP环水解酶的筛选及基因克隆

为了解嘌呤合成途径的关键酶——IMP环水解酶的多样性,从深海沉积物样品中提取总DNA构建Cosmid宏基因组文库,从中筛选出一个具有IMP环水解酶活性的克隆(CAIMP1).通过基因步移的方法从CAIMP1的约35 kb的插入片段中扩增出长度为1 599 bp的完整的IMP环水解酶基因,该基因包含MGS和AICARFT_IMPCHas两个保守结构域.活性检测结果表明CAIMP1克隆的发酵液上清具有较强的IMP环水解酶活性.该酶与数据库中收录的IMP环水解酶的氨基酸序列同源性较低,系统发育分析也表明该酶与其它参照序列亲缘关系较远,表明该序列可能为一个新的IMP环水解酶基因.     

产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).生长特性研究表明,该菌株属于耐冷菌,其最适生长温度为5~15℃.NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶,最适产酶温度为20℃,最高产酶温度为30℃.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究.该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高,它们的最适作用温度分别为30℃和35℃,最适pH值分别为9.0和9.5,对热敏感,是典型的碱性冷适应复合酶.Ca2 、Mn2 、Cu2 、Co2 、Fe3 对该复合酶有较为明显的激活作用,而Zn2 、Hg2 、Rb2 、Cd2 、EDTA则能抑制酶活.其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性.图5表2参21     

南极中山站排污口土壤中微生物群落的DGGE分析

以南极中山站排污口土壤为研究对象,提取样品中微生物宏基因组DNA,用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对宏基因组DNA中的16S rRNA基因V3可变区进行分析,测定了31个不同条带所代表的序列.比较结果显示,排污口土壤样品与相同生境对照样品中的微生物类群组成均以CFB (Cytophaga-Flexibacteria-Bacteroides)类群和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)为主,另外还有少量的α-, β-, δ-变形菌纲,和一些原核的藻类和革兰氏阳性细菌(G ). 但在排污口土壤样品中检出了传染性微生物毛球菌属(Trichococcus)和狡诈菌属(Dolosigranulum),以及丰富的小球藻(Chlorella),说明污水的排放已经对该地微生物群落造成明显的影响.     

产蛋白酶中度嗜盐菌Thalassobacillus sp. SY-7的分离、鉴定及发酵条件优化

为促进嗜盐微生物及其所产蛋白酶的工业应用,采用脱脂奶粉培养基从我国天津近海盐田富集筛选得到产蛋白酶中度嗜盐菌株SY-7.通过对其形态特征、生理生化、16S rRNA基因序列及系统进化树进分析,确定菌株的分类.利用Plackett-Burman(PB)设计和响应面优化法(Response surface methodology)优化其发酵条件.结果表明:菌株SY-7为革兰氏阳性菌,最适生长温度为30℃、最适生长pH 7.5,最适NaCl为10%.16S rRNA基因序列分析显示,菌株SY-7与Thalassobacillus devorans亲缘性最近,16S rRNA基因序列相似性为98.88%.利用PB设计从众多影响因素中筛选出影响较大的3个因素:葡萄糖含量、接种量和装液量;再利用响应面法中的杂合设计进优化,通过拟合得到响应曲面函数,获得了最佳的产酶条件.在该实验条件下酶活从870 U/mL提高到1 390 U/mL,实际酶活力达到理论预测值的98.3%,优化效果较好.     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16