濒危植物厚朴SSR引物筛选及反应体系优化

探索适宜厚朴(Magnolia officinalis)简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的最佳条件.在SSR引物筛选基础上,利用正交试验设计对影响PCR反应的5个因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq酶催化活性浓度)进行4个水平的优化,并通过温度梯度试验优化引物退火温度.在厚朴及其近缘物种的70对引物中,筛选出13对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物.PCR各因素在不同水平下对反应体系的影响由大到小依次为引物浓度、Taq酶催化活性浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板DNA浓度.PCR最佳优化体系:25 μL体系中,模板DNA质量浓度为2 ng·μL-1,引物浓度为0.6μmol·L-1,Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1,dNTPs浓度为0.5 mmol·L-1,Taq酶催化活性浓度为0.03 U·μL-1(1U=16.67 nkat).最佳扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,48.0～59.0℃(退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后72℃延伸10 min.上述结果可为利用SSR-PCR技术研究濒危厚朴群体遗传学和分子生态学提供技术参数.     

不同种源厚朴叶片性状变异及幼苗生长量研究

以全国8省份19个种源的厚朴(Magnolia officinalis)幼苗为研究对象,测定了叶片性状及生长量.结果表明,不同种源间叶片特征值及叶面积、比叶重和叶绿素含量均存在极显著差异,且与几个基本的环境因子间相关性达到显著水平.不同种源间苗高与地径均存在极显著差异,且厚朴种源苗高从南到北变异逐渐降低,地径则从东到西逐渐减小,即苗期地理变异表现为经纬双向变异,但主要还是以南一北变异为主.叶片性状间及与苗高、地径间的相关性分析结果显示,叶形指数与叶片宽在α=0.01水平上呈显著负相关,叶面积与叶柄长、叶片长及叶片宽在α=0.01水平上呈显著正相关,苗高和地径分别与叶面积和比叶重在α=0.05水平上呈显著正相关.聚类分析结果显示,部分地区厚朴种源呈现典型的区域板块化特征,部分地区则呈现随机变异的特征.     

方位及冠层对厚朴果实和种子形态变异的影响

为从方位及冠层的角度探讨光照对厚朴(Magnolia officinalis)果实和种子形态变异的影响,分别从植株的不同方位和冠层采集果实、种子,并测定其形态指标。结果表明,方位对厚朴果实和种子的形态变异影响显著,不同方位厚朴果实和种子的表型性状表现为南方位和东方位优于西方位,南、东和西3个方位均优于北方位;冠层对厚朴果实和种子的形态变异影响显著,不同冠层果实和种子性状表现为中冠层优于上冠层,上冠层优于下冠层;方位和冠层对厚朴果实和种子多项形态指标的协同作用不显著。与果实相比,种子的表型性状更稳定。     

不同生境内厚朴种子萌发和幼苗生长研究

为揭示厚朴(Houpo9a officinalis)种群实生更新方式和影响因素,在遂昌县桂洋林场内选择针叶林、针阔混交林和阔叶林3个不同生境,设置种皮和铁丝网罩交叉处理试验,研究不同生境内厚朴种子萌发和幼苗生长特征。结果显示,不同生境和不同处理间厚朴种子萌发率均有显著差异(P0. 05),在针叶林内去除假种皮且罩铁丝网时厚朴种子萌发率最高,而保留假种皮时厚朴种子萌发率均为0。厚朴在幼苗前期(4~8周)死亡率最大,之后趋于稳定,在针叶林内幼苗存活率最高,但不同生境间差异未达到显著水平。不同生境内厚朴幼苗苗高与地径生长均表现出显著差异(P0. 05),表现为针叶林针阔混交林阔叶林。林中空气温度、湿度、光照强度和枯枝落叶厚度对厚朴种子野外萌发有显著影响,其中温度、光照强度、土壤水分和养分对厚朴幼苗生长影响最大。针叶林最适合厚朴种子萌发和幼苗生长,假种皮、动物取食和生境异质性是造成厚朴种子野外萌发率低和死亡率高的主要原因。     

野生厚朴花粉萌发及花粉管生长过程观察

利用荧光显微镜对野生厚朴(Magnolia officinalis)自然条件下柱头黏附花粉的数量、自花授粉和同株异花授粉时柱头黏附花粉、花粉萌发及花粉管生长过程进行观察.结果显示,自然传粉条件下只有12％的柱头上可以观察到花粉,且每个柱头上黏附的花粉量少;自花授粉后柱头上可以黏附大量花粉,但花粉不能萌发;同株异花授粉后柱头上可黏附大量花粉,花粉可以萌发,但萌发时间推迟,且授粉4h后,多数花粉管停止伸长,花粉管伸长过程中出现末端膨大、生长扭曲等现象,花粉管生长过程中还伴随着一系列胼胝质反应,在柱头上与花粉管的接触处和乳突细胞表面都可以观察到胼胝质,胼胝质的产生阻碍了花粉管的正常伸长.因此,缺乏传粉昆虫和存在受精前障碍是野生厚朴濒危的2个重要原因.