16S rDNA克隆文库方法对制药废水处理系统中微生物多样性的研究

采用分子生物学构建16S rDNA克隆文库的方法对制药废水交替流生物反应器内的微生物群落进行了多样性研究,该反应器对CODcr、氨氮、石油类化合物以及多种特殊污染物均有较高的去除效率.代表序列的BLAST比对结果表明微生物群落具有高度多样性,优势菌群为Proteobacteria,占78.6%.微生物群落分属7个不同纲,优势顺序为Alphaproteobacteria (39.8%),Betaproteobacteria(23.5%),Gammaproteobacteria(14.3%),Chlorobil(6.3%),Firmicutes(4.1%),Flavobacteria (1.0%),Deltaproteobacteria(1.0%.使用Vector NTI Suite 6.0软件对50个OTU的代表序列和NCBI基因库中最相近的已知细菌16S rDNA序列绘制系统进化树,表明克隆子与已知菌之间的基因系统进化关系.     

稻—稻—油菜轮作土壤细菌群落的特征

为了解南方地区稻—稻—油菜轮作后土壤中细菌群落的变化特征,以长达30年的水稻—水稻—油菜轮作和水稻—水稻连作定点栽培试验土壤为研究对象,采用克隆文库和基因序列分析法,通过细菌16S r DNA基因通用引物对土壤提取DNA进行PCR扩增,然后将扩增片段构建克隆文库对克隆子进行测序分析.结果显示,2015年7月、10月和2016年4月3次取样中轮作土壤细菌的香农-维纳指数和辛普森指数均高于连作土壤,轮作土壤细菌多样性高于连作.克隆子序列OTU与Gen Bank比对结果显示,轮作土壤中常见的变形菌(Proteobacteria)占细菌种类的55%,连作土壤为45%;轮作土壤芽单胞菌(Gemmatimonadetes)占细菌种类的13%,连作土壤为10%;轮作土壤中的酸杆菌(Acidobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)和浮霉菌(Planctomycetes)所占细菌比例数小于连作土壤;变形菌和芽单胞菌构成了轮作土壤中的优势菌群,土壤优势菌群的变化对细菌群落结构特征产生影响.测序结果显示稻—稻—油菜轮作土壤优势菌群中α-变形菌、β-变形菌和γ-变形菌高于稻—稻连作;稻—稻—油菜轮作中发现与绿弯菌(Chloroflexi)序列相似菌类,而稻—稻连作土壤中未发现.本研究表明微生物群落结构组成与土壤耕作方式相关,稻—稻—油菜轮作增加了细菌群落丰度.     

低温纤维素降解菌的分离与鉴定

对内蒙古部分地区土壤中低温降解纤维素的微生物进行研究,以期获得一些高酶活的低温纤维素酶产生菌.采用纯培养的方法,在10℃下培养获得纯培养物.以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增后进行序列同源性比对确定种属.以DNS法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件的优化.结果共分离得到55株可低温降解纤维素的菌株,16S rDNA序列分析表明它们分别属于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及β-变形菌纲(β-Proteobacteria).该55株菌的纤维素酶活性均在22℃下最高.其中菌株CF11在10℃下的酶活在分离得到的55株细菌中最高.通过优化,菌株CF11产纤维素酶的最佳条件初步确定为pH值为6.5,培养时间为10 d,并且是以酵母提取物作为氮源,其纤维素酶活为58.091 IU.因此菌株CF11是一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌.     

给水生物预处理反应器的细菌种群多样性和群落结构

提取一生产性规模的给水生物预处理反应器中生物膜样品的总DNA,构建细菌16S rDNA克隆文库,并通过16S rDNA序列的系统发育分析,对生物膜中的细菌种群多样性和群落结构进行了研究.实验结果表明,给水生物膜反应器中的细菌种群多样性十分丰富;生物膜中的细菌分别属于10个主要类群,其中α-Proteobacteria是克隆文库中的最大细菌类群,占克隆子总数的32.28%,其次是β-Proteobacteria;与Rhodobacter系统关系密切的细菌是克隆文库中所占比例最大的一个菌属,占克隆子总数的12.6%;反应器中与硝化作用有关的是Nitrosomonas和Nitrospira属的细菌.研究结果表明,给水生物预处理反应器中的细菌群落结构和废水生物处理反应器中的细菌群落结构是有所差异的.图1表1参13     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

秦皇岛近海养殖对潮间带微生物群落多样性的影响

潮间带微生物群落在驱动海岸带生态系统物质循环和能量流动中具有重要作用,近海养殖造成的环境问题日益凸显,但其对潮间带微生物群落结构的影响还缺乏研究。采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）和限制性片段长度多态性（RFLP）的分子生物学技术,研究秦皇岛养殖区与旅游区潮间带沉积物中微生物多样性的差异,分析养殖区微生物的16S rRNA基因文库的组成特征。结果表明：养殖区的微生物群落结构与旅游区形成较大的差异,DGGE图谱中养殖区的特有条带主要集中于γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）,还分布于α-变形菌纲（α-proteobacteria）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。影响潮间带微生物的群落结构的主要环境因子包括温度、盐度、pH和NO3-浓度,影响率达55.2%。对差异最大的洋河大桥南养殖区（Q1站）的微生物样品建立克隆文库分析群落结构,变形菌门（Proteobacteria）为优势菌群,占总群落的60%,其中γ-变形菌纲是主要存在的微生物纲,其余菌群包括放线菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的微生物。养殖区海岸带微生物群落中出现了与环境污染和赤潮密切相关的菌群,如拟杆菌门、肠杆菌属（Enterobacteriaceae）和α-变形细菌红细菌目（Roseovarius）的微生物。     

广西会仙湿地不同植物根际细菌群落结构及多样性研究

为了研究会仙喀斯特湿地不同植物根际细菌的群落结构和多样性以及环境因子对细菌群落的影响,以秋、冬两季植物根际土壤中提取的总DNA为模板,运用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术,对细菌16S rDNA基因V4+V5进行测序和分析。结果表明,共获得细菌有65门、160纲、219目、391科、677属和246种,不同植物根际土壤中占主导的细菌类群相同,主要包含变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等10个主要门类细菌,其中变形菌门为第一优势菌(平均含量42.4%);优势菌纲有γ-、β-、δ-变形菌纲(Gammaproteobacteria、 Betaproteobacteria、 Deltaproteobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、unidentified_Actinobacteria纲、全噬菌纲(Holophagae),以β-变形菌纲为主(平均含量为13.5%);优势菌属以地杆属(Geobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、厌氧粘菌属(Anaeromyxobacter)为主,以芽孢杆菌属占比最高(占3.8%)。芦苇(Phragmites australis)多样性和丰富度最高,华克拉莎(Cladium chinense)和苦草(Vallisneria natans)次之,美人蕉(Canna indica)最低;冬季土壤细菌多样性高于秋季;美人蕉两季根际细菌群落差异最大,华克拉莎最小。环境因子对细菌群落结构有较大影响,其中土壤TOC、TN影响最显著。从植物根际微生物多样性和丰富度来看,在会仙湿地中增植芦苇和华克拉莎,对维持湿地系统中微生物多样性和湿地的保护有重要意义。     

宿根甘蔗根际土壤细菌多样性分析中培养法与非培养法比较研究

采用培养法和非培养法提取甘蔗根际土壤微生物的总DNA,基于通用引物PCR扩增构建两种方法的细菌16SrDNA文库,并进行核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA),通过部分克隆序列测定构建细菌克隆文库的系统发育树,进而对基于传统的细菌平板培养法和直接提取总细菌DNA的非培养法进行比较分析.结果显示,非培养法文库的香侬–威纳指数、辛普森指数、丰富度分别为4.94、0.998、28.91,均高于培养法文库中相应的多样性参数(分别为4.27、0.996、16.79),均一度数值都>0.95.结合统计学数据和序列测定信息,反映出甘蔗根际土壤存在着丰富的细菌多样性,但平板培养法所展现的多样性低于直接提取法,表明前者存在着很大的局限性,而非培养法文库中主要是未培养微生物的16S rDNA序列,这从一个侧面反映了土壤样品中未培养微生物占很大比例.因此,在土壤微生物群落研究中,必须结合新的分子生态学技术手段,如采用直接提取总DNA的方法进行研究,才能比较全面地认识土壤微生物多样性.图3表3参18     

南极中山站排污口土壤中微生物群落的DGGE分析

以南极中山站排污口土壤为研究对象,提取样品中微生物宏基因组DNA,用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对宏基因组DNA中的16S rRNA基因V3可变区进行分析,测定了31个不同条带所代表的序列.比较结果显示,排污口土壤样品与相同生境对照样品中的微生物类群组成均以CFB (Cytophaga-Flexibacteria-Bacteroides)类群和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)为主,另外还有少量的α-, β-, δ-变形菌纲,和一些原核的藻类和革兰氏阳性细菌(G ). 但在排污口土壤样品中检出了传染性微生物毛球菌属(Trichococcus)和狡诈菌属(Dolosigranulum),以及丰富的小球藻(Chlorella),说明污水的排放已经对该地微生物群落造成明显的影响.     

黄河三角洲湿地土壤微生物群落结构分析

采用末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术和16S rDNA克隆文库的方法,分析了黄河三角洲滨海湿地土壤不同深度细菌和古菌的群落结构.研究表明,随着深度的增加,细菌群落的多样性下降,而古菌群落多样性则有上升的趋势,且土壤的细菌和古菌群落结构都呈现出规律的层状分布.该土壤包括各种硫酸盐还原菌、产甲烷古菌、光合细菌等丰富的细菌和古菌资源.图5参27