西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

西瓜连作对热区土壤微生物多样性的影响

连作障碍一直是困扰人们的一个难题。应用RAPD技术对热区西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai]连作土壤微生物多样性进行研究,为解决西瓜连作障碍提供科学的理论依据。通过对RAPD进行条件优化和引物筛选,筛选出18条RAPD随机引物用于西瓜根根际土壤DNA的扩增,共扩增出154条谱带。154条谱带均为多态性带,PPB为100%,平均每个引物产生8.56条带。并应用RAPD分析不同茬数西瓜4个生育期中根际及非根际土壤微生物多样性和群落变化,以及同一茬数土壤微生物群落各指数在4个不同时期的变化趋势。结果显示,西瓜连作不同生长期根际和非根际土壤微生物多样性的变化均较大,丰富度指数、Dsh和Jsh的变异系数均在29%以上。单因素分析显示,西瓜连作对不同生长期根际微生物多样性的影响显著(P0.05)。进一步分析表明,取样温度与根际、非根际微生物多样性指数呈显著正相关,相关性系数达0.82以上。西瓜连作根际土壤微生物多样性显著下降,不同生长期,根际微生物多样性受连作影响不同,第二茬初果期土壤微生物多样性受影响最大,第3茬初果期次之,变异系数分别达22.43%和15.53%。     

大庆油田聚合物驱后油藏微生物多样性研究

从大庆油田4个聚合物驱后的采油井中提取总DNA,扩增其16S rDNA片段,克隆到大肠杆菌,然后用ARDRA法对所得的298个克隆中的插入片段进行分析,建立了16S rDNA克隆文库.采用文库库容值(C)、香农-威纳指数(H)和均匀度指数(E)对文库微生物多样性进行了评价.结果表明,4个样品中共得出22个操作分类单元(OUT).其中4个OUT(在整个群落中占78.18%,9个OUT只有一个克隆.对22个OUT的代表克隆序列、GenBank数据库比对和系统发育分析表明,聚驱后油井中的细菌基本属于α变形菌纲(24.83%)、γ变形菌纲(23.49%)、δ变形菌纲(35.56%)和未培养微生物(16.78%).与石油烃降解和产生物表面活性剂相关的假单胞菌(Pseudomonas)和不动杆菌(Acinetobacter),在文库中占的比例分别是17.79%和6.02%.     

马铃薯根际与非根际土壤微生物群落结构及多样性特征

利用Illumina-MiSeq高通量测序技术对马铃薯根际与非根际土壤中细菌的16Sr DNA基因V3-V4区片段和真菌18S r DNA基因V4区片段进行了测序,研究马铃薯根际与非根际土壤微生物群落多样性及其与土壤养分之间的关系,为马铃薯健康种植提供理论数据。结果表明,(1)马铃薯根际土壤pH显著低于非根际(P0.05),根际土壤电导率、有机碳、全氮、速效氮和速效磷均显著高于非根际(P0.05),而根际土壤全磷与非根际差异不显著(P0.05)。(2)马铃薯根际土壤细菌和真菌均匀度指数(Simpson)、多样性指数(Shannon-Wiener)、ACE、Chao1均显著高于非根际(P0.05);而根际土壤细菌和真菌覆盖度(Coverage)、Simpson指数与非根际差异不显著(P0.05)。(3)马铃薯根际和非根际土壤细菌群落中,优势类群主要是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),还包括浮霉菌门(Planctomycetaceae)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia),其中根际土壤细菌酸杆菌门相对丰度高于非根际,变形菌门相对丰度低于非根际。根际和非根际土壤真菌群落中,优势类群主要是子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota),还有结合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、芽枝菌门(Blastocladiomycota)。(4)主成分分析(PCA)表明,马铃薯根际和非根际土壤细菌和真菌群落具有很好的相似性,并且细菌群落产生明显的分离效应。Pearson相关性分析表明,马铃薯土壤细菌和真菌Coverage、ACE与土壤养分均没有显著相关性(P0.05);土壤pH与土壤细菌和真菌多样性呈负相关,土壤电导率和全磷与土壤细菌和真菌多样性均没有显著相关性(P0.05)。(5)冗余分析(RDA)显示,7个土壤环境因子分别解释了细菌86%和真菌82%的总特征值,说明土壤环境因子对马铃薯土壤细菌和真菌多样性有显著影响,其中对土壤细菌和真菌多样性影响较大的有有机碳和全氮,而pH对土壤细菌和真菌多样性影响为负。由此可知,土壤pH值是马铃薯根际土壤微生物多样性的重要影响因子。     

稻—稻—油菜轮作土壤细菌群落的特征

为了解南方地区稻—稻—油菜轮作后土壤中细菌群落的变化特征,以长达30年的水稻—水稻—油菜轮作和水稻—水稻连作定点栽培试验土壤为研究对象,采用克隆文库和基因序列分析法,通过细菌16S r DNA基因通用引物对土壤提取DNA进行PCR扩增,然后将扩增片段构建克隆文库对克隆子进行测序分析.结果显示,2015年7月、10月和2016年4月3次取样中轮作土壤细菌的香农-维纳指数和辛普森指数均高于连作土壤,轮作土壤细菌多样性高于连作.克隆子序列OTU与Gen Bank比对结果显示,轮作土壤中常见的变形菌(Proteobacteria)占细菌种类的55%,连作土壤为45%;轮作土壤芽单胞菌(Gemmatimonadetes)占细菌种类的13%,连作土壤为10%;轮作土壤中的酸杆菌(Acidobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)和浮霉菌(Planctomycetes)所占细菌比例数小于连作土壤;变形菌和芽单胞菌构成了轮作土壤中的优势菌群,土壤优势菌群的变化对细菌群落结构特征产生影响.测序结果显示稻—稻—油菜轮作土壤优势菌群中α-变形菌、β-变形菌和γ-变形菌高于稻—稻连作;稻—稻—油菜轮作中发现与绿弯菌(Chloroflexi)序列相似菌类,而稻—稻连作土壤中未发现.本研究表明微生物群落结构组成与土壤耕作方式相关,稻—稻—油菜轮作增加了细菌群落丰度.     

烟区轮作与连作土壤细菌群落多样性比较

采用从土壤中直接提取土壤细菌总DNA,并用细菌16SrDNA特异性引物进行PCR扩增和变性梯度凝胶电泳（DGGE）的方法,对比研究了贵州福泉烟区轮作和连作对土壤细菌群落多样性的影响,每个处理样品3次重复在DGGE图谱中相似性较高,基本聚在一起,从整体证明了试验操作方法较为精确。由DGGE图谱可知,轮作土壤微生物条带数量15-31条不等,平均为23条。连作土壤微生物条带数量从7-25条不等,平均为18条。分别从每条泳道的条带数和光密度值两方面,对细菌群落多样性指标进行了比较。结果表明,轮作处理细菌群落丰富度指数均大于连作处理,轮作Shannon-wiener和辛普森指数（1/D）均大于连作,表明轮作微生物多样性较连作高,轮作方式可以提高植烟土壤细菌群落的多样性。     

云南玉溪烟区轮作与连作土壤细菌群落多样性比较研究

为评价云南玉溪烟区轮作和连作对土壤细菌群落多样性影响,从土壤中直接提取土壤细菌总DNA,用细菌16S rDNA特异性引物进行PCR扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE),每个处理样品3次重复,在DGGE图谱中相似性较高,基本聚在一起,从整体证明了试验操作方法较为精确.从泳道分析图可知,轮作土壤细菌群落各泳道条带数量13～29条不等,平均为21条.连作土壤细菌群落各泳道条带数量从4～20条不等,平均为12条.从每条泳道的条带数方面和光密度值分别进行细菌群落多样性各指标的比较,结果表明,轮作处理细菌群落丰富度指数均大于连作处理,轮作香农-威纳和辛普森指数(1/D)均大于连作,表明轮作微生物多样性较连作高,轮作方式可以提高植烟土壤细菌群落的多样性.     

转Bt基因玉米种植对土壤细菌数量及多样性的影响

利用三室根箱装置获得玉米生长室土壤(S I)、根际土(SⅡ)、非根际土(SⅢ)3个不同根区土壤,采用传统平板计数培养与变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术相结合的方法,研究了转基因玉米Btll及其非转基因亲本在播种后40、50、60 d各根区土壤细菌数量及多样性的变化.结果表明,转Bt基因玉米播种后50、60 d S I根区土壤可培养细菌数量显著低于非转基因亲本,播种后40、50 d SⅡ根区土壤可培养细菌数量较亲本玉米显著增加,而在其他时期和根区与亲本玉米之间均无显著差异.DGGE图谱显示,3个采样时期各根区DGGE图谱条带数、土壤细菌多样性指数和均匀度指数均无显著差异(P＞0.05).     

种植杞柳在镉污染土壤修复过程中对土壤微生物群落结构和理化性质的影响

研究种植杞柳在镉污染土壤修复过程中对微生物群落结构的影响,可为应用杞柳-微生物联合修复镉污染土壤提供理论依据.以1年生杞柳扦插苗为试验材料进行盆栽试验,设置4个镉浓度梯度处理(0、50、100以及150 mg/kg),每个处理同时设置种植杞柳组和未种植杞柳组.种植杞柳1年后收集根际、非根际以及未种植杞柳土壤,对土壤理化性质、不同形态重金属含量进行测定,利用Biolog-ECO平板法对微生物代谢功能多样性进行测定以及利用T-RFLP法对微生物群落结构多样性进行测定.采用冗余分析(RDA)对微生物群落结构多样性与土壤理化性质、不同形态重金属含量的相关性进行分析.结果表明,在镉污染处理组中养分含量总体呈现种植杞柳组高于未种植杞柳组,不同土壤来源对6类碳源的平均利用率存在显著差异,碳水化合物和酚酸类相对利用率呈现种植杞柳土壤未种植土壤,而氨基酸、羧酸、多聚物以及胺类相对利用率都在根际土壤中最高.对照组与处理组根际微生物丰富度与多样性指数差异不显著,但优势微生物种类明显不同. RDA分析表明,与对照相比,受污染的土壤中微生物与环境因子的相关性更强,可还原态镉与优势菌株B-T-RFs(137)、B-T-RFs(141)等有较强的相关性.综上,种植杞柳能显著促进镉污染土壤中微生物代谢活性、微生物丰富度指数以及多样性指数,对优势微生物种群、代谢组成有明显影响;影响根际与非根际土壤中优势微生物的主要环境因子不同,污染组微生物受环境影响更大.(图8表1参50)     

给水生物预处理反应器的细菌种群多样性和群落结构

提取一生产性规模的给水生物预处理反应器中生物膜样品的总DNA,构建细菌16S rDNA克隆文库,并通过16S rDNA序列的系统发育分析,对生物膜中的细菌种群多样性和群落结构进行了研究.实验结果表明,给水生物膜反应器中的细菌种群多样性十分丰富;生物膜中的细菌分别属于10个主要类群,其中α-Proteobacteria是克隆文库中的最大细菌类群,占克隆子总数的32.28%,其次是β-Proteobacteria;与Rhodobacter系统关系密切的细菌是克隆文库中所占比例最大的一个菌属,占克隆子总数的12.6%;反应器中与硝化作用有关的是Nitrosomonas和Nitrospira属的细菌.研究结果表明,给水生物预处理反应器中的细菌群落结构和废水生物处理反应器中的细菌群落结构是有所差异的.图1表1参13     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

基于秀丽隐杆线虫的微量水样环境毒理学研究

目前,环境水样个体水平的毒理学检测成本较高、耗时长,且检测后的水样若处理不当易造成环境的二次污染。通过使用易于培养和观察、个体微小的模式生物—秀丽隐杆线虫作为实验对象,利用毛细玻璃管的虹吸原理将线虫暴露于微量的环境水样进行染毒培养,实现微量水样在个体水平的毒理学评价。为了验证该方法的可行性,检测了暴露组线虫与对照组线虫的生殖腺细胞损伤水平、活性氧自由基(ROS)产生量、氧化应激水平、脱氧核糖核酸(DNA)损伤水平等生物终点的差异性。研究结果有助于为微量环境水样在个体水平的毒理学分析提供一种快速、可行、廉价的评价手段。     

Duckweeds for water remediation and toxicity testing

The presence of toxic substances in wastewaters and outdoor bodies of water is an important ecotoxicological issue. The aim of this review is to illustrate how duckweeds, which are small, simply constructed, floating aquatic plants, are well suited to addressing this concern. The ability of duckweeds to grow rapidly on nutrient-rich water and to facilitate the removal of many substances from aqueous solution comprises the potential of these macrophytes for the remediation of wastewater and polluted aqueous reservoirs, while producing usable biomass containing the unwanted substances having been taken up. Their ease of cultivation under controlled and even sterile conditions makes duckweeds excellent test organisms for determining the toxicity of water contaminants, and duckweeds are important as model aquatic plants in the assessment of ecotoxicity. Duckweeds are also valuable for establishing biomarkers for the toxic effects of water contaminants on aquatic higher plants, but the current usefulness of duckweed biomarkers for identifying toxicants is limited. The recent sequencing of a duckweed genome holds the promise of combining the determination of water contaminant toxicity with toxicant diagnostics by means of gene expression profiling via DNA microarrays.     

苯乙烯致DNA间接损伤效应的光电化学生物传感器快速检测

许多有机化合物自身没有致癌毒性,但进入生物体内,经过体内代谢酶的催化后转化成活性中间体,与DNA形成共价化合物.这些间接的损伤会最终导致DNA分子结构和功能的变化,对人类的健康造成威胁.因此,建立一种快速有效的方法检测间接致癌化合物对DNA的损伤,成为当前研究的热点.论文建立了一种新型的光电化学生物传感器来检测有机化合物苯乙烯对DNA的间接损伤效应,该传感器以层层自组装的方式将光电信号分子、双链DNA和血红蛋白组装在半导体电极上.在H2O2存在的条件下,传感膜中的血红蛋白可将苯乙烯转化为氧化苯乙烯,氧化苯乙烯扩散到膜内,与DNA形成加合物,引起DNA结构变化,导致光电分子光电流信号的增加.实验中,将修饰好的电极置于终浓度为2mM H2O2和2%苯乙烯(体积比)的混合液(pH7.3的磷酸缓冲液配制)中反应一段时间后,在电解质溶液中进行光电流检测.实验结果表明,光电流信号随着反应时间逐渐升高,在30min后趋于稳定,表明苯乙烯在传感膜上的氧化和DNA的损伤反应基本完成.与反应前相比,反应后光电流增加了40%,并且酶催化苯乙烯生成的氧化苯乙烯经紫外可见光谱得到验证.论文建立的光电化学生物传感器模拟了体内DNA损伤反应过程,能快速有效地检测苯乙烯对DNA的间接损伤效应,有望为有机化合物潜在基因毒性的风险评估提供一个快速筛查工具。     

Enhanced production of laccase by Coriolus hirsutus using molasses distillery wastewater

The effect of physical parameters of cultivation (load volume, temperature, pH, agitation, inoculum size, and incubation period) in the production of laccase by wood-rotting basidiomycete Coriolus hirsutus were studied using diluted molasses distillery wastewater (MDW) as a major composition. Using fractional factorial design, our study first identified load volume, agitation, and inoculum size as statistically significant factors. Optimal preferences and mutual interactions of the factors were then determined by the response surface method, which is based on the center composite design. A quadratic model was used to fit the experimental data. The optimized operational parameters for laccase production were determined to be the following: culture temperature of 25°C, pH 4, load volume of 40 mL diluted MDW in 150 mL flask, agitation rate of 183 r·min^?1, inoculation of 11.5% v/v, and cultivation time of 6 d. The experimental validation under these conditions (the maximum laccase production of 2198.2 U·mL^?1 was within the confidence interval) subsequently verified the accuracy of the constructed model. Moreover, the removal of chemical oxygen demand and nitrogen of MDW reached 62.85% and 48.00% respectively, and the decolorization ratio under the optimal condition was 41.85%. The enhanced production of laccase by C. hirsutus is a new recovery strategy for MDW.     

小流域面源污染减控措施优化管理

以长春市重要饮用水源地石头口门水库的莫家沟小流域为研究区,选择横垄耕作、修建梯田、退耕还林、化肥减施和人工湿地5种措施进行磷素削减处理,共计21个措施组合方案;以实施措施的费用最小为目标函数,以水库水质TP浓度和采用不同措施的土地面积为约束条件,建立小流域出口水质优化管理模型。模拟计算3个阶段的可行性最优方案分别为:2011—2020年,选取措施为施肥量不变,现状梯田面积不变,坡度≤5°的耕地采取横垄耕作,其他退耕还林;2021—2030年,在第一阶段实施方案的基础上,新建人工湿地0.03 km2;2031—2050年,全部农田原位退耕还林,保持人工湿地面积不变,最终实现入库水质ρ(TP)≤0.01 mg.L-1的目标。化肥减施和梯田建设面积是影响方案选择的主要因素。     

人G—CSF转基因鼠系与正常鼠系比较研究

利用人ＧＣＳＦ基因组基因和ｃＤＮＡ基因作为目的片段,将其受控于２．６ｋｂ的小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控区下,通过显微注射法获得了两只整合有人ＧＣＳＦ转基因小鼠,通过繁殖建立了稳定的转基因系．一些表型参数测定表明,转基因鼠与正常鼠无明显差别,为对转基因动物进行安全性评价提供了依据     

转座子挽救法克隆鞘氨醇单胞菌CDS-1中呋喃丹水解酶相关基因

用含Tn5转座子的自杀性质粒pSC123诱变呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1,获得失去呋喃丹降解功能的突变株CDS-M1.以pMD18-T为载体在E.coli DH5α中构建了CDS-M1的基因组文库,采用转座子挽救法对Tn5插入位点两侧翼的序列进行克隆与测序,根据测序结果(共4 551个碱基)设计引物,从CDS-1的基因组中扩增到同样大小的片段,把该片断克隆到广宿主载体pPZP201上,得到重组质粒pCDZ1,通过三亲接合的方法把pCDZ1导入CDS-M1中进行功能互补实验,结果显示CDS-M1的呋喃丹水解功能得到了恢复,表明该片断中包含呋喃丹水解酶相关基因.图7表1参14     

生物炭早期植物毒性评估培养方法研究

为更加科学地评估生物炭潜在植物毒性,采用生物炭(B)、生物炭+土壤(B+S)、生物炭水浸提液+土壤(AE+S)、生物炭+石英砂(B+Q)、生物炭水浸提液+石英砂(AE+Q)5种不同的培养方法进行早期植物毒性效应实验。比较分析不同培养方法中西红柿种子发芽率、根长、芽长对生物炭的响应。结果表明:在5种培养方法中,随生物炭剂量增加,西红柿种子发芽率、根长、芽长呈现先增后降的变化趋势。虽在低剂量生物炭处理下(10.0 g·kg~(-1)),种子萌发表现出促进作用。但随剂量增加,除B+S和AE+S外,均表现出一定的抑制作用,且当剂量为160.0 g·kg~(-1)时,抑制作用达到最大。对比有土和无土培养方法中种子萌发情况发现,在高剂量下,无土培养方法中种子发芽率,根、芽生长所受抑制作用显著高于有土培养方法。无土方法中,尤其AE+Q方法中,高剂量生物炭对种子发芽率、根长、芽长表现出最大的抑制作用,其中发芽率抑制率为91.1%,根长抑制率为77.7%,芽长抑制率为93.7%。综合比较分析,生物炭水浸提液+石英砂(AE+Q)的培养方法干扰因子少,可提高毒性响应灵敏度。因此,在生物炭早期植物毒性效应评估中,该法可作为推荐的培养方法。