质粒DNA小量提取法的改进

介绍了一种改进的小量提取质粒DNA的方法,该方法用NH4Ac和LiCl代替常规方法中苯酚和氯仿的抽提,有效去除了样品中RNA和蛋白质;用95%乙醇代替无水乙醇沉淀质粒DNA,降低了终产物中盐和多糖等杂质的含量,获得的质粒DNA质量好,产率高,能满足常规分子生物学实验的要求,如PCR、酶切、转化大肠杆菌以及植物遗传转化.图4表1参7     

活性污泥总DNA不同提取方法的比较

为了快速、简便和经济地获得活性污泥的总DNA,以用于分子生物学研究,采用5种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过提取的核酸总量、纯度、是否含有聚合酶链反应抑制剂等指标综合分析不同的提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明:蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取活性污泥总DNA效果最好,提取DNA总量多,纯度高,可不经纯化直接进行PCR扩增反应。     

植物根瘤内痕量Frankia DNA的提取及鉴定

建立了一种简捷、快速植物根瘤内痕量Frankia DNA的提取方法，即采集自然态下根瘤，剥离瘤瓣，取瘤瓣尖经液氮研主民粉末，以20g/L CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）消化胞壁，然后以d=5-10μm的石英粉吸附DNA，再以无菌去离子蒸馏水释放DNA，所获DNA产率及纯度较酚／氯仿法好。经对辽宁沙棘、色赤杨根瘤的瘤内痕量Frankia DNA及体外培养的9种Frankia菌株DNA分纯，并用于酶切及PCR，获满意结果。图3参12     

活性污泥宏基因组芯片DNA的制备方法

宏基因组芯片的探针是通过构建环境DNA的宏基因组文库而获得的,为了获得理想的活性污泥宏基因组文库和宏基因组芯片探针,必须获得高质量的活性污泥DNA.本文作者采用8种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过比较DNA总量、纯度、完整性、是否含有PCR酶抑制剂、能否进行限制性内切酶酶切等指标来评价不同提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明,溶菌酶-SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提处理活性污泥所提取的总DNA效果最好,提取的DNA总量多、纯度高,DNA片段大于23 kb,无需进一步纯化就可直接进行PCR扩增反应或SauA Ⅰ限制性内切酶酶切,但DNA如果需要EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶酶切,则需采用Roche公司琼脂糖凝胶回收试剂盒将DNA进一步回收纯化.图7表3参14     

一种提取富含油脂植物组织总RNA的改良SDS酸酚法

采用常规的方法提取富含油脂的植物组织总RNA常难以取得满意的结果.对林莎两次裂解法进行了改良,即将SDS的浓度降低至1%,所用酸酚的pH值降低至4.0,去掉提取液Ⅱ处理步骤,获得的总RNA效果较好:得率高,RNA产量可达74.7 μg(100 mg)-1;没有DNA污染,A260 nm/A280 nm/2.026,A260 nm/A230 nm值为2.082,说明蛋白质及其它污染非常低,通过RT-PCR成功地扩增出了麻疯树curcin基因长为927 bp的特异条带.相比林莎的方法,改良SDS酸酚法具有经济、简便、适用性广的特点.图5表1参13     

水稻总DNA的快速制备

采用两种不同的简单方法,均不接触有毒的有机试剂,且不需液氮速冻研磨,快速地制备水稻总DNA,用于SSR、STS等检测,效果稳定可靠.其中TritonX-100法提取的DNA具有很好的完整性,可用于后续其他分子生物学操作;NaOH法提取的DNA虽然降解严重,但是及时用于PCR及相关分析同样可行.两种方法均可在短时间内处理大批量的样品,操作简单,效果可靠,适于对杂种后代进行遗传连锁分析和分子标记辅助选育时的单株检测.图2表1参8     

底泥水体中适用于PCR的不同形态DNA的提取方法（Methods of Extraction Different Gene Types of Sediments and Water for PCR Amplification）

提出直接从环境河流底泥和表层水体中同时提取不同形态DNA(胞内、胞外、染色体和质粒DNA)的有效方法.利用该方法提取了海河典型区域底泥的胞外DNA和胞内DNA及水体中细菌染色体DNA和质粒DNA.结果表明,NaH2PO4提取的胞外DNA分子量大于1kb,提取率40%～72%,没有共提取胞内DNA.胞内DNA提取的分子量均大于23.1kb,细菌质粒DNA与染色体DNA同时分离.16SrDNA与sul2扩增验证提取方法可靠性.16SrDNA扩增结果显示所有胞外DNA呈阴性,胞内DNA呈阳性.质粒DNA和染色体DNA的16SrDNA扩增显示,染色体DNA结果显阳性,质粒DNA呈阴性,sul2的结果相反.     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

蒽醌和十二烷基苯磺酸钠胁迫对鲈鱼DNA损伤的RAPD分析

从40条随机引物筛选出6条，对暴露于蒽醌（0．0195mol／L）和十二烷基苯磺酸钠（100mg／L）海水溶液的鲈鱼基因组DNA进行RAPD扩增反应，检测DNA受损情况．实验结果显示，在蒽醌暴露实验中，引物OPA-03检测到鲈鱼在污染7d时的血液和肝脏DNA受到损伤，扩增结果缺失片段大小约为0．9kb特征带．在十二烷基苯磺酸钠污染实验中，不论是作用于鲈鱼个体，还是直接污染其DNA，用所筛选出的6条引物扩增结果未发现对基因组DNA造成损伤，图3表1参22     

白菜叶绿体DNA快速提取及分析

采用SDS-蛋白酶法提取了白菜的叶绿体DNA.琼脂糖电泳及紫外分光光度分析表明,所提取的叶绿体DNA质量高,除cpDNA主环外,在胞质雄性不育新种质及原不育系中还存在约1375bp和831bp的两条质粒分子.用所提取的叶绿体DNA作为模板进行RAPD扩增,获得了清晰的扩增图谱.该方法与传统的提取方法相比省时、高效、无污染.图2表1参14     

海洋微藻活体及乙醇固定状态下基因组DNA的微量提取方法

探讨了海洋微藻活体及固定状态下基因组DNA的提取方法,即作者改进的CTAB法.结果表明,CTAB改进法提取的基因组DNA蛋白质、酚、盐和小分子的污染较少,多糖成份也得到了有效去除.用5%乙醇固定样本提取DNA的效果最好,对原生动物抑制效果也较明显;10%以上的乙醇可杀死原生动物,但对DNA的降解率较大;30%以上的乙醇对细菌抑制较明显,但DNA都有较大程度的降解.本法提取的DNA可用于正常的酶切和PCR.用甲醛、甲醇/冰醋酸等其它固定液固定样品,DNA的得率低或者质量和纯度低.图7表1参27     

Acclimation of the European sea bass to freshwater: monitoring genetic changes by RAPD polymerase chain reaction to detect DNA polymorphisms

We investigated the use of the polymerase chain reaction (PCR) and the associated random amplification of polymorphic DNA (RAPD) technique to study variation in samples of the sea bass, Dicentrarchus labrax, before and after acclimation to freshwater. Acclimation trials were repeated twice, in 1989 and 1990, for two samples originating from the same broodstock (individuals from different localities along the Italian coasts), with overall mortality rates averaging 94 and 75% in the 2 yr, respectively. Analyses are based on 126 polymorphic RAPD markers, scored in at least 39 individuals for each of the starting and acclimated samples in both years. Analysis of RAPD patterns revealed high levels of DNA polymorphism in both 1989 and 1990 starting samples. The acclimated samples maintained similar polymorphism levels. Shifts in marker frequencies between starting and acclimated samples occurred in both years. A correspondence analysis carried out on multimarker individual profiles suggests that the two starting samples resulted from uneven sampling of the same heterogenous broodstock. This analysis clearly separates RAPD phenotypes from starting and acclimated samples in both years and identifies the RAPD markers responsible for such displacement. Patterns of RAPD variation are compared with previous allozymic studies carried out on the same samples. A major difference between the two studies was the number of markers available. Fewer allozyme loci were studied than were RAPD markers. The cause of repeated shifts for allozyme alleles in replicate experiments were almost certainly due to selection, while statistical chance could explain the repeated shift of only one out of more than 100 RAPD markers. We have shown that RAPD analysis, if carried out carefully, is quite reproducible and sensitive enough to reveal high levels of variation among individuals from the same broodstock. A major drawback of this approach is the still unclear inheritance patterns of RAPD polymorphisms. The use of multivariate analyses is suggested as a possible alternative to traditional population genetics techniques to analyze patterns of variation in the absence of a precise genetic interpretation.     

ERIC-PCR:一种快速鉴别环境细菌菌株的方法

以 Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ（ 肠杆菌基因间共有重多序列） 序列设计的特异引物对３ 株大肠杆菌、３ 株软腐欧氏杆菌、２ 株草生欧氏杆菌、１ 株梨火疫欧氏杆菌、１ 株催娩克氏菌、１ 株阴沟肠杆菌和９ 株具有降酚能力的细菌等２０ 种细菌的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 分析．每种菌株均存在数目不等的各自独特的带型,能够区分同一种类中极为相近的菌株．经多次重复,各特异性扩增的主要带型能重复稳定出现．聚类分析的结果表明,供试菌株多数按照分类地位归到相应的组中．９ 种具有降酚能力的细菌中,２ 种分离自处理焦化废水池活性污泥,７ 种来自土壤样品． Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ Ｐ Ｃ Ｒ 指纹图显示,前２ 种属于一类,都有一条大小约１ ．１ ｋｂ 的主带,其它７ 种土壤中分离出来的细菌除其中１ 种有１ 条约１ ．２ ｋｂ 大小的主带外,其余６ 种都有１ 条大小约１ ．４ ｋｂ 的带．聚类分析将从土壤中分离出来的细菌归为３ 种不同的类型． Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ Ｐ Ｃ Ｒ 可以从分子水平对细菌基因组进行快速指纹图分析,在对环境细菌分离物进行快速鉴定和归类等方面具有实用价值     

从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究

针对荔枝体内含有大量影响ＤＮＡ提取质量的多酚等次生代谢物质的特点，在常规ＳＤＳ和ＣＴＡＢ提取方法的基础上做了技术改进，即在核裂解之间先破碎细胞，将存在于细胞质中次生物质除去后再裂解细胞核，同时加入活性炭以吸咐杂质反复清洗几次后加入核型解液释放基因组ＤＮＡ，纯化之后经外观和电泳检测，以及Ｄ２６０ｎｍ和Ｄ２８０ｎｍ比值的测定，限制性内切酶反应，ＰＣＲ扩增的结果表明，用改进方法提取的ＤＮＡ无论在纯度上还     

Measuring copepod naupliar abundance in a subtropical bay using quantitative PCR

Copepod nauplii are important in plankton food web dynamics, but limited information is available about their ecology due to methodological challenges. Reported here is a new molecular method that was developed, optimized, and tested in laboratory and field samples that uses quantitative PCR (qPCR) to identify and estimate the abundance of nauplii of the planktonic copepod, Parvocalanus crassirostris. The overall approach included collection of bulk zooplankton samples in the field, size fractionation to create artificial cohorts of relatively few developmental stages, obtaining DNA copy number for each size fraction by qPCR amplification of a target gene region, and estimation of the number of animals in each fraction through application of known DNA copy number across developmental stage. Method validation studies found that our qPCR-based approach has comparable accuracy to microscope-based counts of early developmental stages. Naupliar abundance estimates obtained using the two methods on cultured populations were similar; the regression of qPCR estimates on microscope-based counts resulted in a nearly 1:1 ratio (slope = 1.09). The qPCR-based method is superior to traditional identification and quantification methods for nauplii due to its higher taxonomic resolution, sensitive detection over a range of DNA quantities, and relatively high throughput sample processing.     

无苯酚培养基分离到的降酚菌多样性的分子分析

用3种不含苯酚的培养基(YPG、10%YPG和LB)从上海焦化厂废水处理系统(A2/O法)好氧池的悬浮污泥分离到24株降酚菌株.通过16SrDNAPCR扩增产物的限制性酶切分析(amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)、ERICPCR指纹图谱分析、多组分苯酚羟化酶大亚基(thelargestsubunitofthemulticomponentphenolhydroxylase,LmPH)基因的PCR扩增及16SrRNA基因测序的方法对这些降酚菌株进行表征.通过ARDRA分型,将这24株降酚菌株分为8个类型;利用ERICPCR可以将这24个菌株分为17种类型,说明同一ARDRA类型内菌株具有多样性.对17个ERIC类型代表菌株的16SrDNA扩增产物进行克隆并测序,测序结果在GenBank和RDP中进行比对.结果表明,与这17个代表菌株同源性最高的菌中,有6株是未见报道具有降酚功能的菌株.在这24株降酚菌中,有19株在苯酚含量为200mg/L的MP培养基中培养5d,苯酚降解率为20%左右,其余5株苯酚降解率达到100%,且均属于Rhodococcus属.本研究在降酚菌生物多样性上作了有益的探索.图2表1参20     

环介导恒温扩增技术快速检测短凯伦藻

短凯伦藻(Karenia brevis)是一种有毒赤潮微藻,所产生的短藻毒素对海洋生物乃至人类都有毒害作用,为加强对短凯伦藻赤潮的监控,建立了稳定的短凯伦藻环介导恒温扩增(LAMP)鉴定体系,在此基础上进行了特异性和灵敏性验证.特异性实验结果显示只有短凯伦藻或者含短凯伦藻的模板呈现阳性反应,其他微藻为阴性反应,从而验证了该LAMP方法的特异性;同时,对短凯伦藻的基因组DNA进行一系列10倍稀释作为敏感度实验的模板,并与常规PCR做了对比,结果表明:短凯伦藻的LAMP方法最低检测限度为50 pg,敏感度比常规PCR高10倍.LAMP产物鉴定不需要常规的胶电泳过程,直接采用肉眼观察的方法,在含有短凯伦藻的阳性反应管中会出现白色混浊,加入SYBRòGreen I染料呈现绿色,而未含有短凯伦藻的阴性管为澄清,染色后仍为原来的橙色.因此,该方法操作简便、特异性强、灵敏度高而成本低,在赤潮原因种检测监控方面具有良好的应用前景.