不同补给水源的城市人工湖中异养菌耐药性及耐药菌种属分布研究

为了阐明不同补给水源的城市人工湖中异养菌耐药状况和耐药菌种属分布特征,选取分别以地表水和再生水为补水来源的XQ湖和FQ湖为代表进行研究。从2018年4—11月逐月采集水样,考察了各水样中对氨苄西林(AMP)、磺胺甲恶唑(SMZ)和四环素(TET)这3种不同种类抗生素具有耐药性的异养菌含量,并对分离菌株的耐药表型、耐药菌株的种属分布以及水质理化指标进行了分析。结果表明,2处人工湖中的AMP耐药菌和SMZ耐药菌含量约为10~2～10~4CFU·(100 m L)~(-1),而TET耐药菌含量则约10~1～10~3CFU·(100 m L)~(-1)。分离出的84株耐药菌归属于19个种,其中蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌和鸟氨酸拉乌尔菌为2个湖共有耐药菌。71.4%的耐药菌都是对AMP单一耐药,以蜡状芽孢杆菌为主。由于具有固有耐药性的细菌在分离出的耐药菌中占比很低,获得性耐药很可能在城市人工湖中异养菌耐药性的发展上发挥了主要贡献作用。地表水补水的XQ湖和再生水补水的FQ湖在总异养菌含量、耐药菌含量和检出率上均无显著差异。分离来源对16株耐药性气单胞菌的聚类无明显影响。     

MBR工艺处理螺旋霉素制药废水过程中抗生素耐药菌与抗性基因的研究

抗生素废水含有大量的抗生素耐药菌(antibiotic resistant bacteria,ARB)与抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs),处理排放后可能增强受纳环境的微生物抗性,因此有必要深入研究抗生素废水处理过程中ARB与ARGs的削减效果及其影响因素。本研究采用膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)工艺处理螺旋霉素制药废水,考察了不同水力停留时间(hydraulic retention time,HRT)对ARB与ARGs削减效果的影响。结果表明,虽然在HRT=30 h时MBR对COD与氨氮的去除率略高于HRT=40 h,但HRT=40 h时,不仅总异养菌与肠球菌的去除效果更佳,出水肠球菌耐药率及携带的抗性基因检出率也更低,而且MBR对废水中erm B、erm F、erm X、mef A、ere A、mph B和转移元件ISCR 1、Tn 916/1545相对丰度的削减效果更好。这表明长HRT更有利于MBR工艺削减螺旋霉素废水的耐药菌与抗性基因。     

施用畜禽粪便有机肥土壤抗生素抗性基因污染状况

为研究施用畜禽粪便有机肥农田土壤中抗生素抗性基因的分布状况,采集北京地区9个长期施用有机肥蔬菜基地的温室和大田土壤,对土壤中的抗生素耐药菌和18种抗性基因进行检测分析。结果表明,温室土壤中四环素耐药菌占总菌数的比例显著高于大田土壤(P0.05),但温室土壤中氨苄西林、磺胺甲恶唑和环丙沙星耐药菌占总菌数的比例均与大田土壤无显著性差异(P0.05)。大田土壤和温室土壤中磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2和四环素类抗性基因tet L的检出率均为100%。其他抗性基因,如四环素抗性基因tet A、tet A/P、tet C,红霉素抗性基因erm B,以及Ⅰ类整合子(intⅠ1),温室土壤的检出率均高于大田土壤,这可能与温室土壤有机肥施用量较大有关。     

天津水产业磺胺类耐药细菌及其分布

水产养殖中抗生素的滥用可能会诱导水产品和周围环境中的耐药菌.针对天津市北辰区、西青区、东丽区和津南区的6个水产养殖场的底泥和水样,采用抗性平板筛选耐药细菌,通过对磺胺甲恶唑的耐药率分析,发现底泥中的耐药率要大大高于水中的耐药率,并且与国外的某些研究相比,底泥的细菌耐药率呈现较高的趋势.另外,利用16S-rDNA鉴定出8...     

磺胺类耐药菌中抗性基因sul的表达规律

抗生素环境污染是影响抗生素抗性基因传播和扩散的主要因素,然而关于抗生素耐药菌在抗生素暴露下抗性基因的表达机制研究甚少。本研究利用RT-PCR方法检测了土壤中优势耐药菌菌株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis SYN201,G+)和弗氏志贺菌菌株(Shigella flexneri NJJN802,G-)在含有不同浓度磺胺类药物的培养基中生长不同时间后抗性基因(sul 1、sul 2、sul 3)的表达变化。结果发现:无论培养基中是否存在磺胺类药物,菌株SYN201和NJJN802中的3种磺胺类抗性基因均分别在培养的第72小时或36小时出现一个明显的表达峰,而在其他培养时间下不表达或表达量处于相对极低的水平;磺胺嘧啶的存在有助于提高菌株在此特征表达时间下抗性基因的表达水平,与未加磺胺嘧啶组相比,暴露于磺胺嘧啶(60μg·m L~(-1))组的sul 1、sul 2和sul 3在菌株SYN201中的相对表达量分别提高了2.5、4.8和3.2倍,而在菌株NJJN802中的相对表达量分别提高了3.7、6.0和5.0倍。通过将耐药菌暴露于不同磺胺嘧啶浓度下考察sul基因相对表达情况,研究发现随着培养基中磺胺嘧啶浓度的升高(0~1 024μg·m L~(-1)),菌株SYN201和NJJN802中sul基因的表达量整体上呈现出明显的上升趋势。本研究对揭示磺胺耐药菌的抗性表达规律及抗生素暴露对其抗性表达发挥的作用具有重要意义。     

水环境中耐热大肠菌群的抗生素耐药性与质粒谱研究

用滤膜法、mFC培养基从5种水体中分离出疑似耐热大肠菌162株,用API微生物分析系统鉴定到种,以Kirby-Bauer法分析其对人畜常用10种抗生素的耐药性,碱裂解法小量制备各菌株质粒DNA做质粒谱分析.结果表明,埃希氏大肠杆菌为优势菌,占分离菌总数的96.3%.除分离自泉水的3株外,其它菌株都对3种及3种以上抗生素耐药,多重耐药率为98.1%.不同水体分离菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素的耐药率有显著性差异(P<0.005).92株菌(56.8%)提取到大小为0.90～158.83kb、数量为1～6个的质粒,有81种质粒谱型.70株(43.2%)未提取到质粒的细菌中有67株为多重耐药.具有相同质粒谱型的菌株耐药谱都不相同.未发现质粒谱与抗生素耐药性间有明显相关性.图1表3参15     

链霉菌S227抗耐药性物质的分离及其活性研究

在抗耐药性活性筛选过程中,发现分离自四川峨嵋山森林土壤的一株链霉菌S227(Streptomyces sp.)的发酵液具有抗细菌抗生素耐药性生物活性.利用已建立的抗耐药性的活性检测方法(专利号:ZL01128969.4)[1]为跟踪手段,采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析以及薄层层析等方法,对该菌发酵液中抗耐药性活性物质进行分离纯化,得到了具有抗耐药性的活性单体S227-4,初步鉴定为四聚糖.利用MIC法对该样品的抗耐药活性进行研究:在证明该样品本身不具有抗菌活性的基础上,以临床分离的耐药菌株为指示菌,考察了该样品与抗生素联合使用时对耐药菌抗生素MIC(最小抑菌浓度)值的影响,结果表明,S227-4在不影响耐药菌生长的浓度下与不同的抗生素联合使用,可以明显提高不同耐药菌对不同抗生素的敏感性,如S227-4(200μg/mL)可以使S.aureus12334对红霉素的敏感性提高128倍.图2表2参8     

养殖场空气中E.coli磺胺类抗生素的抗性

本文从养殖场空气中分离出360株E.coli(大肠杆菌,Escherichia coli),应用肉汤微量稀释法和PCR方法,分离磺胺甲唑敏感菌株,检测抗生素抗性和抗性基因.在分离的E.coli中,对磺胺甲唑敏感菌株为95株(26.4%),有48株含有青霉素、氯霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素和利福平的抗性,而47株未含有抗性.其中,7株菌株含有1种抗生素抗性、11株菌株含有2种抗生素抗性、17株菌株含有3种抗生素抗性、6株菌株含有4种抗生素抗性、4株菌株含有5种抗生素抗性、3株菌株含有6种抗生素抗性.对抗生素的耐受能力依次为:氯霉素、青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、利福平.磺胺甲唑敏感菌株共检出163个抗性基因,sul1、int1、sul2、Int2、sul3检出数量依次为49、44、29、20和19;含一种、二种、三种、四种、五种抗性基因菌株分别为45、22、10、7、2;但有6株未检测出抗性基因.结果表明养殖场建场时间、抗生素使用、养殖规模等与抗生素抗性菌的抗性呈正相关;养殖场空气中分离的E.coli抗生素抗性较高,且具有多重抗性;抗生素抗性的表现型与其基因型之间出现不完全吻合现象.     

混合菌对石油的降解

从含油污水中分离得到4株能高效降解石油的微生物菌株(X2、X3、X4、X5),经鉴定,4株菌分别属于黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、动胶菌属(Zoogloea sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和邻单胞菌属(Plesiomonas sp.).通过观察4株菌在原油培养基中的生长变化过程,确定了其中的优势菌;并对4株菌进行复配实验以确定各株菌混合后的石油降解效果;用正交实验法确定达到最佳石油降解效果各菌的投加量;通过对残油的Gc-MS测定分析,确定各菌在降解石油时所起的作用.结果表明,混合菌株中菌X4为优势菌,且有高的降解效果(达68,60％),其它3株降解率不高的菌混合投加也能达到较高的降解效果(达63.17％),菌X4是混合菌株维持高降解率的关键;达到最佳降解效果的各菌投加量分别为0.1％、0.1％、0.5％、2.0％;菌X2和菌X3降解C12-C16直链烃和少量支链烃,菌X4和菌X5对C12-C22直链烃有好的降解效果.图2表4参10     

土壤氨氧化细菌对大气CO2浓度增高的响应

利用FACE(free-air carbon dioxide enrichment,开放式空气CO2浓度增高)试验平台,研究大气CO2浓度增高对土壤氨氧化细菌的数量、优势菌群及其硝化活性的影响.结果表明,大气CO2浓度增高时,土壤氨氧化细菌的数量在常氮水平上趋于减少,而在高氮水平上与对照没有差异.大气CO2浓度增高对土壤氨氧化细菌的优势菌群也产生明显影响.CO2浓度增高条件下,亚硝化球菌(Nitrosococcus sp.)和亚硝化弧菌(Nitrosovibrio sp.)是优势菌属;而在对照条件下,亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)和亚硝化球菌(Nitrosococcus sp.)是优势菌属.另外,CO2浓度增高条件下优势菌株的硝化活性也有不同程度的减弱.     

产类胡萝卜素菌株的筛选及其培养条件初探

从土壤、植物落花、细菌污染的组织培养二三角瓶里的培养基上及被细菌污染的LB琼脂平板上分离筛选出十几株产类胡萝卜素的菌株，其中从污染的LB琼脂平板上分离的一株菌落颜色为黄色的菌株PBH，分类鉴定为库特氏菌属(Kurthia sp.)．菌株在以葡萄糖为碳源，添加番茄汁(3．6mL／L)、芝麻油(1．6mL／L)、Na2CO3(6g/L)和磷酸缓冲盐的液体培养基中28℃振荡培养5d，每mL培养液细胞生物量湿重达到65．57mg，类胡萝卜素产量达到9．896μg，菌体每g湿重细胞胡萝卜素含量为150．9μg．图10参13     

一株积聚四氢嘧啶的青海湖盐单胞菌的分离及特性

从青海湖采集20份水样,利用RM高盐培养基分离获得35株嗜盐菌.选取其中一株优势中度嗜盐菌QHL25进行形态学和生理生化特征分析,结果表明:QHL25菌落圆形或椭圆形,乳白色,不透明,中心突出,边缘透明,生长盐度为0~2.9 mol/L,最适生长盐度为1.45 mol/L.显微形态呈短杆状,革兰氏染色呈阴性,单个或成串排列.最适生长pH为8.5,最适生长温度为37℃.16S rDNA序列分析表明:该菌株与盐单胞菌属(Halomonas sp.)相似性为98%;结合形态特征和生理生化特征分析,初步认定该菌株隶属于γ变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)盐单胞菌科(Holomonadaceae)盐单胞菌属(Holomonas).薄层层析(TLC)定性分析可知QHL25胞内含有相容溶质四氢嘧啶;高效液相色谱(HPLC)定量分析表明,在1.7 mol/L的NaCl浓度下,四氢嘧啶含量约为36.70 mg/g(细胞干重).     

高效纤维素降解菌分离筛选、复合菌系构建及秸秆降解效果分析

从川西高原贡嘎山区杜鹃林下土壤中分离纤维素降解菌,构建具有高效降解纤维素能力的复合菌系,并对秸秆降解效果进行分析,为农业废弃物的循环利用提供菌种资源和理论依据.样品及经风干、高温等预处理后,采用平板涂布法进行分离,共获得79株菌株;通过刚果红实验对分离获得的菌株进行初步筛选,运用DNS法测定各菌株的羧甲基纤维素酶活(Carboxymethyl cellulase,CMCase),复筛得到15株具有CMCase活能力的菌株.经滤纸条崩解实验、秸秆崩解实验及降解率测定,最终确定了各菌株的纤维素降解能力,进一步经拮抗实验,选取相互无拮抗的菌株构建5个复合菌系:A(112、146、156、171),B(145、147、150、153),C(110、116、174),D(147、154、171),E(145、146、150、152、153).复合菌系的滤纸酶活(Fpase)与秸秆降解率测定结果显示,组合C对秸秆的降解率较单菌株116提高了50.71%,组合D对秸秆的降解率较单菌株154提高了41.54%.经形态学和分子生物学鉴定,纤维素降解能力比较好的两个组合中的菌株分别被鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)以及链霉菌属(Streptomyces sp.).本研究表明,复合菌系纤维素降解能力优于单一菌株,C、D两组复合菌系表现出较高的纤维素降解能力,具有进一步开发的价值.     

畜禽养殖场附近污水中多粘菌素E耐药性肠杆菌的分离分析及内源质粒检测

畜禽养殖业大量使用抗生素引起了广泛的微生物耐药性问题,研究抗生素耐药菌株可以了解环境中细菌的耐药性情况和抗性基因的传播机制。采集畜禽养殖场周边的污水,分析了污水中多粘菌素E耐药性细菌和耐药性肠杆菌的丰度;同时以一株具有较高多粘菌素E耐药水平的肠杆菌R11为例,首先进行16S r DNA测序和抗生素耐药谱分析,然后通过质粒提取、酶切电泳以及脉冲场凝胶电泳(PFGE),分析其内源性质粒等情况。结果表明:在畜禽养殖场周边污水环境中,多粘菌素E耐药性细菌占细菌总数的0.14%~0.35%,多粘菌素E耐药性肠杆菌占肠杆菌总数的1.50%~7.40%,而肠杆菌占细菌总数的1.13%~2.45%,说明肠杆菌可能是携带多粘菌素E抗性基因的主要细菌种类,同时也是养殖业污水中细菌的主要组成部分。16S r DNA序列分析确定R11是一株Enterobacter cloacae,抗生素耐药谱分析R11具有多重耐药性,除对林可霉素敏感外,阿米卡星、四环素和环丙沙星的最小抑菌浓度(MICs)为10μg?m L~(-1),阿莫西林的MICs为25μg?m L~(-1),磺胺甲恶唑的MICs为32μg?m L~(-1),氨苄西林的MICs为40μg?m L~(-1),链霉素的MICs为90μg?m L~(-1),而多粘菌素E的MICs最高,达到96μg?m L~(-1)。质粒提取酶切和PFGE分离鉴定结果显示,R11菌株可能有多个内源性质粒。综上所述,R11菌株具有较高水平的多粘菌素E耐药性,并且具有多重耐药性和多个内源性质粒,对于研究多粘菌素E耐药性机制具有一定的参考价值。     

土壤氨氧化细菌对大气CO2浓度增高的响应

摘要：利用FACE(free．aircarbondioxideenrichment，开放式空气CO2浓度增高)试验平台，研究大气CO2浓度增高对土壤氨氧化细菌的数量、优势菌群及其硝化活性的影响。结果表明，大气CO2浓度增高时，土壤氨氧化细菌的数量在常氮水平上趋于而在高氮水平上与对照没有差异。大气CO2浓度增高对土壤氨氧化细菌的优势菌群也产生明显影响。CO2浓度增高条件下，亚硝化球菌(Nitrosococcus sp.)和亚硝化弧菌(Nitrosovibrio sp．)是优势菌属；而在对照条件下，亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp．)和亚硝化球菌(Nitrosococcus sp．)是优势菌属。另外，CO2浓度增高条件下优势菌株的硝化活性也有不同程度的减弱。     

粘细菌的活性检测及与环境因子的相关性

为筛选具有抗菌活性的粘细菌,利用兔粪诱导、大肠杆菌划线诱导和滤纸诱导3种方法从内蒙古凉城地区采集的20种土样中分离粘细菌,结合形态观察、生理生化特征和分子鉴定方法确定这些菌株的分类地位,通过平板对峙法分析抗菌活性,并采用统计学方法分析其与环境因子的相关性.共分离得到140株菌,包括39株纯粘细菌,经鉴定分别为黄色粘球菌(17株)、橙色粘球菌(13株)、变绿粘球菌(5株),还有4株只鉴定到粘球菌属(Myxococcus sp.).抗菌结果显示:39株纯菌均表现出可以对一种甚至多种指示菌产生抗性,其中37株抑制大肠杆菌的生长,35株抑制马铃薯晚疫病菌的生长,26株抑制金黄色葡萄球菌的生长,20株抑制酿酒酵母菌的生长,19株抑制枯草芽孢杆菌的生长.在分析环境因子与粘细菌分布情况的关系时发现,分离出的溶细菌类群的菌株数、溶纤维素类群的菌株数及总的菌株数与土壤p H和速效钾的含量呈正相关,与含水量呈负相关,与其它参数无明显相关性.综上,内蒙古凉城地区粘细菌的优势菌群为粘球菌属,且绝大多数都有不同程度的抗菌活性;结果可为丰富内蒙古地区粘细菌资源及抗马铃薯晚疫病农药研发奠定基础.     

土壤栽培和无土栽培菜心中内生细菌比较及分离鉴定

菜心(Brassica parachinensis)是华南地区的一种特色蔬菜.为探究无土栽培和土壤栽培菜心内生细菌的差异,以这两种栽培方式的菜心为材料,分离内生细菌.根据插入序列指纹图谱(IS-PCR)结果进行聚类,对代表性菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,并将菌株加入无土栽培营养液中,收获后测定菜心的的相对叶绿素含量(SPAD)和可溶性糖含量.结果显示,从两种菜心中共分离到31株内生细菌,IS-PCR结果将其聚为9个类群,16S rRNA基因鉴定其分别属于Bacillus sp.(芽孢杆菌属)、Rhizobium sp.(根瘤菌属)、Microbacterium sp.(微杆菌属)、Leifsonia sp.(雷夫松氏菌属)、Sphingomonassp.(鞘氨醇单胞菌属)、Alcaligenessp.(产碱菌属)和Agrobacteriumsp.(农杆菌属).土壤栽培菜心中可培养细菌数目多于无土栽培菜心,且土壤栽培菜心中内生细菌的碳代谢更多样化.生理生化实验显示,部分菌株能分泌生长素和铁载体.加入土壤栽培菜心中分离得到的菌株SCG14和SCG0802后,无土栽培菜心的相对叶绿素含量和可溶性糖含量比对照显著提高.本研究表明无土栽培和土壤栽培的菜心中的内生细菌在种类、数目、分布部位和碳源利用能力上有差异;此外,分离得到的菌株能提高无土栽培菜心的相对叶绿素以及可溶性糖含量,有开发为微生物制剂的潜力.(图4表6参35)     

牛粪发酵过程中抗生素耐药基因及相关菌群组成变化规律

随着规模化奶牛养殖迅速发展,牛粪带来的环境污染问题日益严重。实验探究牛粪及其堆肥过程中养分变化、抗生素耐药基因消减情况以及细菌群落演替规律,探讨细菌菌群与养分、抗生素耐药基因之间的相关性。采集牛粪及其堆肥过程样品,测定样品中养分、检测抗生素耐药基因相对丰度,采用16S r RNA高通量测序技术研究牛粪堆肥过程细菌群落变化。结果表明,从新鲜牛粪(组FM)到发酵牛粪(组C),样品中有机质含量下降,全氮和全磷含量有不同程度增加,全钾(TK)显著升高(P<0.05)。堆肥发酵后,抗生素耐药基因erm B、tet M、bla CTX-M和aac(6')-Ib-cr的相对丰度呈现不同程度的下降,而基因sul1相对丰度增加。高通量测序结果表明,在门水平,各组均以Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes这3个菌门为主,在属水平,各组具有不同的优势物种,其中发现Bacteroides、Paeniclostridium和Pseudomonas等7个潜在病原菌属的相对丰度在堆肥后有效降低。通过相关性分析发现,潜在病原菌属与基因tet M和sul1呈显著正相关(P<0.05),此外,大部分优势菌属与养分TK有显著相关性(P<0.05)。研究结果表明,牛粪经堆肥发酵后,病原菌相对丰度有效降低,抗生素耐药基因相对丰度的下降与细菌菌群结构变化存在相关关系。     

水体中氧化铁鞘细菌的分离鉴定及保藏

采用试管静止富集培养及生态模拟富集培养，结合平板划线、稀释涂布、平板滴加法，成功地从150份水样中分离到94株鞘细菌．利用Winogradsky液体试管法进行产铁氧化酶鞘细菌的快速初筛，从中筛选出24株产铁氧化酶能力较高的菌株，再经摇瓶复筛，获得产酶活性最高的菌株FC9901．采用多相鉴定方法对菌株FC9901细胞形态、培养特征、生理生化反应及各种碳源利用情况进行了研究，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版，把该菌株鉴定为第十四群鞘细菌类(sheathed bacteria)球衣菌属(Sphaerotilus)浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)．对鞘细菌几种保藏方法进行比较研究，结果表明蒸馏水保藏法保藏时间长，是一种经济简便有效的保藏方法．图3表7参9     

原油降解细菌ODB01的筛选、鉴定及降解特性

从长庆油田被原油污染土壤中筛选出1株以原油为唯一碳源的菌株ODB01。经菌株生理生化特征及16S r DNA序列分析,鉴定为肠杆菌属(Enterobacter sp.)细菌;运用响应曲面法优化细菌ODB01对原油的降解条件为p H值为8.91,w(NaCl)为1.19%,油菌比为1∶4.12,温度为36.78℃,在该条件下细菌ODB01对原油的降解率为34.6%;分别添加w=0.05%土温80(Tween 80)和w=0.05%辛基苯基醚(Triton X-100)后,细菌ODB01对原油降解率分别达到42.5%和46.1%。结果表明,细菌ODB01对原油具有一定的降解能力,有望作为一种微生物修复剂进行开发。