鸡、猪粪便源大肠杆菌对4种抗生素耐药性的比较

以琼脂稀释法对67株鸡源大肠杆菌及61株猪源大肠杆菌进行最低抑菌浓度(MIC)测定,并以SPSS分别进行卡方检验和Probit模型估算,分析不同来源大肠杆菌耐药差异显著性及不同抗生素的半数抑菌浓度(MIC50),以期对不同畜禽粪便来源的大肠杆菌耐药差异进行详细准确的探讨。结果显示,鸡源大肠杆菌对头孢噻肟、诺氟沙星、环丙沙星和四环素耐药率分别为98.51%、68.66%、56.72%和100%,猪源大肠杆菌对头孢噻肟耐药率为88.52%,对诺氟沙星、环丙沙星和四环素则100%耐药。除四环素,鸡源、猪源大肠杆菌对诺氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟的耐受差异显著(P0.05),51%的鸡源大肠杆菌和89%的猪源大肠杆菌均呈4重耐药。SPSS分析结果表明,Probit模型估算结果优于当前MIC50常规计算方法,头孢噻肟、诺氟沙星、环丙沙星和四环素对鸡源大肠杆菌MIC50分别为40.031μg·m L~(-1)、40.020μg·m L~(-1)、2.683μg·m L~(-1)和101.418μg·m L~(-1),对猪源大肠杆菌MIC50分别为8.724μg·m L~(-1)、56.044μg·m L~(-1)、31.214μg·m L~(-1)和130.915μg·m L~(-1)。回归方程显示环丙沙星对鸡源大肠杆菌抑制作用最强;高于40.031μg·m L~(-1)时,诺氟沙星抗菌作用弱于头孢噻肟,低于120.23μg·m L~(-1)时,诺氟沙星抗菌作用强于四环素;头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星和四环素对猪源大肠杆菌的抑菌作用则呈递减趋势。同时验证了诺氟沙星和环丙沙星属同种作用机制,基于Probit模型计算更简单、快速、直观。研究结果可为畜禽养殖中大肠杆菌的耐药差异监控提供一定的数据基础。     

蛋鸡场中大肠杆菌对抗生素及消毒剂的耐药性

为了解蛋鸡场中抗生素、消毒剂的耐药情况,从蛋鸡场的环境(粪便、土壤、水体等)和鸡蛋中分离大肠杆菌,测定7种抗生素和2种季铵盐消毒剂对大肠杆菌的最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),检测18种抗生素耐药基因和5种季铵盐消毒剂耐药基因,并对大肠杆菌进行脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析.共得到44株大肠杆菌;大肠杆菌对抗生素耐药率为6.82%-90.91%,对土霉素(OTC)耐药率最高,对庆大霉素(CN)耐药率最低,所有大肠杆菌对头孢噻呋钠(CFS)表现敏感,一共产生14种不同的耐药谱型,其中,AMLTMP-OTC是最主要的谱型(N=10,P=23.81%);抗生素耐药基因检出率为2.27%-84.09%,tet C检出率最高,qnr A检出率最低.消毒剂苯扎氯铵(Benzalkonium chloride,BC)、氯化十六烷基吡啶(Cetylpyridinium chloride,CPC)对大肠杆菌的MIC范围分别为8-64μg/m L、4-256μg/m L,仅检测出qac EΔ1耐药基因(N=18,P=40.91%),qac EΔ1阳性大肠杆菌与甲氧苄啶(TMP)耐药表型存在显著相关性(P0.05);44株大肠杆菌PFGE基因型相似性在32.11%-96.62%之间.本研究表明蛋鸡场中大肠杆菌存在交叉传播的情况,对部分抗生素耐药性严重,同时对消毒剂出现耐药性,应引起足够重视.     

畜禽养殖场排放物病原微生物危险性调查

以粪大肠菌群和沙门菌为指标,采集江苏省内10家不同养殖类型畜禽养殖场的排放物及其周边水、土样共37个进行观察与计数,同时分析排放污水中大肠杆菌的耐药性以及禽畜排泄物对土壤和水体耐药细菌数的影响.结果表明:调查的10家养殖场中有9家粪便未经无害化处理直接排放到水体或施于农田,且排放物的粪大肠菌群数全部严重超标,沙门菌检出率达19%,施新鲜粪肥的土壤中粪大肠菌群数(MPN,最大可能数)在105 g-1以上,水体中分离出的大肠杆菌表现出多重耐药性,抗生素抗性细菌总数也远高于未施新鲜粪肥的土壤及水体.     

链霉菌S227抗耐药性物质的分离及其活性研究

在抗耐药性活性筛选过程中,发现分离自四川峨嵋山森林土壤的一株链霉菌S227(Streptomyces sp.)的发酵液具有抗细菌抗生素耐药性生物活性.利用已建立的抗耐药性的活性检测方法(专利号:ZL01128969.4)[1]为跟踪手段,采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析以及薄层层析等方法,对该菌发酵液中抗耐药性活性物质进行分离纯化,得到了具有抗耐药性的活性单体S227-4,初步鉴定为四聚糖.利用MIC法对该样品的抗耐药活性进行研究:在证明该样品本身不具有抗菌活性的基础上,以临床分离的耐药菌株为指示菌,考察了该样品与抗生素联合使用时对耐药菌抗生素MIC(最小抑菌浓度)值的影响,结果表明,S227-4在不影响耐药菌生长的浓度下与不同的抗生素联合使用,可以明显提高不同耐药菌对不同抗生素的敏感性,如S227-4(200μg/mL)可以使S.aureus12334对红霉素的敏感性提高128倍.图2表2参8     

山东某污水处理厂中环型和线型甲基硅氧烷的行为归趋

本文研究了山东某污水处理厂污水及污泥中3种环型甲基硅氧烷(D4—D6,CMS)和12种线型甲基硅氧烷(L5—L16,LMS)的行为归趋.进水中总甲基硅氧烷(∑MS)的浓度为15.7—65.7μg·L~(-1)(平均值:39.2μg·L~(-1)),其中∑LMS占比为98. 2%.进水中∑MS浓度夏季最高(65. 7μg·L~(-1)),其次分别是秋季(41.7μg·L~(-1))、冬季(33.7μg·L~(-1))和春季(15.7μg·L~(-1)).出水中∑MS浓度为6.24—14.3μg·L~(-1)(平均值:10.6μg·L~(-1)),平均去除率为73.0%.污泥中∑MS的浓度为14.1—48.4μg·g~(-1)(平均值:20.3μg·g~(-1)),D4—D6的泥水分配系数(lg Kd)为3.84—4.44,L6—L16的lg Kd为2.24—4.30.此外,通过计算甲基硅氧烷的危险商数(hazard quotients,HQ)评估了其对水生生物的危害,发现污水处理厂出水中目标化合物的潜在危害较低.     

环境浓度抗生素选择性压力改变活性污泥微生物群落结构

为探究环境浓度抗生素(5μg·L~(-1)和50μg·L~(-1))选择性压力下活性污泥微生物的性能变化,选择四环素及磺胺甲噁唑2种高频检出的抗生素作为研究对象,分别考察2种抗生素单一和复合作用下对序批式活性污泥反应器(SBR)中废水处理效能、微生物活性及群落结构的影响。结果表明,与不添加抗生素的空白对照组相比,2种抗生素在50μg·L~(-1)和5μg·L~(-1)暴露浓度下,经过60 d运行,COD和NH+4-N去除效果未受明显影响(P0.05),微生物的活菌比变化不显著(P0.05),ATP含量显著降低(P0.05)。在微生物群落结构方面,革兰氏阳性菌增加,革兰氏阴性菌减少,原生动物含量减少,香农-威尔生物多样性指数下降。添加抗生素的样品中微生物优势菌群由变形菌门变为放线菌门,放线菌含量(均高于45%),高于空白对照组(30.72%);放线菌门的Micropruina属所占比例最高(24%),且高于空白对照组(18.77%)。抗生素选择性压力可改变活性污泥微生物的活性及群落结构,但长期作用下对污水处理效能及抗生素抗性基因传播的影响还需要进一步研究。     

长江三角洲地区典型废水中抗生素的初步分析

采用高效液相色谱-串联质谱方法,对城市生活污水、养猪场和甲鱼养殖场废水进行抗生素污染检测.污水处理厂污水中检出磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑3种磺胺类抗生素,浓度都低于5 μg·l-1.养猪场废水中检出磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺氯哒嗪5种磺胺类抗生素(＜5μg·l-1),四环素类的四环素、土霉素和强力霉素(30.05-100.75μg·l-1).甲鱼养殖场废水检出氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3种氯霉素抗生素,浓度低于检测下限0.1μg·l-1.结果表明,在3种典型废水中,养猪场废水检出抗生素的种类最多,浓度也最高;磺胺类在3种废水中检出频率最高,尤其是磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲氧嘧啶.说明城市生活污水、畜禽养殖场废水和水产养殖废水都是水环境潜在的抗生素污染源.     

给水管网流速对水质和生物膜种群结构的影响

为了解析水流流速对给水管网的影响,采用给水管网模拟系统,动态监测28 d内的水质,对第28日的生物膜进行生物量测定和16S r DNA测序;并利用统计分析方法解析主体水水质和生物膜之间的相互关系.结果显示:在流速为0.5 m/s时,主体水中总有机碳(TOC)最为丰富(5.26±0.17 mg/L),悬浮细菌总数(n)最多[lg(n+1/m L~(-1))=4.79±0.02],综合水质为最差(3.69),而且生物膜细菌总数(n)最大[lg(n+1/cm~(-2))=5.48±0.06];Pearson相关分析显示,不同流速下生物膜细菌总数与主体水水质指标中的电导率(R=0.73,P0.01)、浊度(R=0.87,P0.001)、TOC(R=0.94,P0.001)和细菌总数(R=0.92,P0.001)成正相关,与余氯(R=-0.68,P0.05)成负相关;在低流速(0.1 m/s)和高流速(2.5 m/s)条件下生物膜多样性较高,而在0.5 m/s流速下,生物膜细菌种群多样性处于最低水平;变形菌门(Proteobacteria)在生物膜的群落结构中占主导地位.本研究表明给水管网流速影响水质和生物膜种群结构,水质与生物膜种群结构存在相互关系,结果可为管网生物膜的研究提供理论依据.     

红谷霉素对细菌耐药性质粒转移的抑制作用

以Shigella flexneri D15 R-plasmid CmR和Escherichia coil 1485 RifR为试验菌株,研究红谷霉素对细菌耐药性质粒在细菌之间转移的抑制作用及对两种细菌R质粒的消除作用.将红谷霉素(30μg/mL)与S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coli 1485 RifR按实验设计混合并分别培养24 h和48 h,涂布在麦康凯琼脂平板上,计算相应菌落数.结果表明,当红谷霉素抑菌浓度为30μg/mL时,对细菌耐氯霉素的R质粒的转移抑制率分别达到92.82%(24 h培养)和96.04%(48 h培养),但对R质粒的消除作用不显著.说明红谷霉素对R质粒转移抑制作用强烈但不具有R质粒的消除作用.     

莱州湾近岸海域中典型抗生素与抗性细菌分布特征及其内在相关性

为了揭示海陆衔接区环境中抗生素与抗性细菌分布特征及其内在相关性,以莱州湾及其主要入海河流为研究区域,利用HPLC-MS/MS分析样品中15种磺胺类抗生素(SAs)和6种喹诺酮类抗生素(QNs)的浓度,并通过改良的Method 1604(US EPA)评估海水与沉积物中2种典型水传病原微生物大肠杆菌(E.coli)与金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗生素抗性水平,进而探讨该区域水体中抗性菌株的分布特点以及微生物抗性率与相应抗生素浓度的相关性。结果显示,莱州湾水体与沉积物中普遍存在磺胺与喹诺酮类抗生素残留及抗性污染问题。两大类抗生素在水体中平均残留浓度分别为3.89 ng·L~(-1)(SAs)和234.68ng·L~(-1)(QNs),在沉积物中分别为0.91 ng·g~(-1)(SAs)和49.37 ng·g~(-1)(QNs),且分布特征基本呈现自河流向海洋逐渐递减的趋势,说明河流输入是莱州湾抗生素污染的主要来源。在水体中,具有磺胺类抗性的E.coli和S.aureus平均检出量分别达到2 018和4 683 CFU·L~(-1),抗性率范围分别在0%~37.3%和10.6%~45.8%之间;而2种喹诺酮类抗性病原微生物的平均检出量则相对较低,分别为1 315 CFU·L~(-1)(E.coli)和1 461 CFU·L~(-1)(S.aureus),抗性率分别为0%~50.0%和0%~20.8%;此外,相比于E.coli,S.aureus为沉积物中的主要抗性病原微生物,磺胺与喹诺酮类抗性S.aureus检出率均高于80%,平均检出量分别为24CFU·g~(-1)和18 CFU·g~(-1)。相关性分析表明,莱州湾近岸海域水体中磺胺类抗生素浓度与磺胺类抗性微生物总量之间具有良好的线性关系,然而其与微生物抗性率之间并未表现出相似的规律,说明近岸海洋环境中抗生素的残留量不是影响抗性菌株丰度的唯一因素。     

乙基化衍生-顶空固相微萃取-气相色谱质谱法测定水中的三甲基铅和三乙基铅

建立了四乙基硼化钠衍生、50μm/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头顶空固相微萃取、气相色谱质谱仪检测水中三甲基铅和三乙基铅的方法,用于地表水、生活污水和工业废水中三甲基铅和三乙基铅的检测分析.实验优化了顶空固相微萃取条件,研究了萃取纤维、衍生试剂的用量、萃取时间、萃取温度和解析时间对萃取效果的影响.优化条件下,三甲基铅和三乙基铅的检出限分别为0.3μg·L~(-1)和0.2μg·L~(-1),在3个加标水平(5、100、180μg·L~(-1))下,地表水、生活污水和工业废水中目标物的加标回收率分别为81.0%—115%、74.1%—116%和88.4%—111%,相对标准偏差均小于10%.实验操作简单,无需有毒的有机溶剂,且方法灵敏度高,精密度和准确度好,适用于水中三甲基铅和三乙基铅的快速痕量分析.     

饮用水中九种卤乙酰胺的高效液相色谱-三重四极杆质谱测定方法

本文应用固相萃取前处理方法和高效液相色谱-三重四极杆电喷雾质谱(HPLC-ESI/tq MS),优化并建立了9种氯代和溴代乙酰胺的同时测定方法.结果显示,在流动相甲醇/水(5/95,V/V)、流速0.3 m L·min-1、正离子模式条件下,9种卤乙酰胺的线性范围是5—200μg·L~(-1)或10—500μg·L~(-1)(R20.99),9种卤乙酰胺检出限为0.5—9.2μg·L~(-1).经过比较HLB是最优的固相萃取柱.在0.02、0.2、0.5μg·L~(-1)的3个加标水平下,9种卤乙酰胺的回收率分别为61%—84%、60%—93%和70%—104%,相对标准偏差为1.7%—4.4%、1.1%—4.1%和0.8%—4.1%.     

固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定养猪废水中11种抗生素残留

建立了养猪废水中11种抗生素多残留的液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法.样品以乙腈为提取溶剂,经振荡旋混方式提取,提取液以HLB固相萃取为净化手段,有效降低样品中复杂基质所带来的背景干扰,采用HPLC-MS/MS定性分析、外标法定量.方法的相关系数r0.999,最小检出限为0.048—4.5μg·L~(-1).在加标水平为10.0、20.0、50.0μg·L~(-1)时,11种抗生素的平均回收率为57%—104%,相对标准偏差小于14%(n=6).实验证明,本方法是一种快速、准确、灵敏度高的检测养猪废水样品中11种抗生素残留量的检测方法.     

采用超高效液质联用法测定水体中十二烷基硫酸钠

采用离线固相萃取(SPE)对水体样品中的十二烷基硫酸钠进行了富集浓缩,同时,采用超高效液相色谱与质谱联用仪(UHPLC-MS)对样品进行了准确定性与快速分析.结果表明,该方法的线性回归方程为y=752.1x-5.97,相关系数r=0.995,线性范围为0.05—50μg·m L~(-1),方法定量限为0.05μg·m L~(-1).采用该方法对浦东某区域水体3份样品进行了分析,结果显示水体中十二烷基硫酸钠的含量为未检出—0.011μg·m L~(-1)之间,样品基质加标回收率为67.0%—105.0%,RSD值为5.8%.     

亚抑菌浓度氟苯尼考作用下质粒pSD11对大肠杆菌适应性的影响

通过分析cfr阳性质粒pSD11对大肠杆菌的适应性影响,并测定氟苯尼考对携带质粒pSD11的大肠杆菌MG1655(Escherichia col MG1655)的最低筛选浓度(MSC),评价亚抑菌浓度氟苯尼考作用下多重耐药基因cfr在大肠杆菌中的持续存在和扩散传播的风险.通过电转化的方法将质粒pSD11导入模式菌E.coli MG1655中,获得耐药菌株E.coli MG1655/pSD11.通过测定生长曲线,比较无抗生素作用下耐药菌株E.coli MG1655/pSD11与同源敏感菌株E.coli MG1655的生长动力学参数,评价质粒pSD11对宿主菌适应性的影响.并通过比较分析不同亚抑菌浓度(0.031 25,0.062 5,0.125,0.25,0.5,1.0和2.0μg/mL)氟苯尼考作用下的生长速率,测定氟苯尼考对携带质粒pSD11的宿主菌最小筛选浓度(MSC).携带质粒pSD11的耐药菌E.coli MG1655/pSD11的延滞时间(2.853 3±0.031 8 h/λ)相对于同源敏感菌E.coli MG1655极显著延长(2.825 3±0.024 4 h/λ),且世代时间也显著延长(分别为:1.705 7±0.006 4 h/G和1.526 9±0.007 8 h/G).氟苯尼考对耐药菌E.coli MG1655/pSD11的MSC为0.042 5μg/mL约为相应敏感菌的MICsus的1/100.本研究表明携带cfr基因的质粒pSD11在无抗生素选择下对宿主菌有明显的适应性影响,但是在极低的氟苯尼考浓度的作用下存在选择优势,能够平衡适应性成本使宿主菌得到富集与传播,以期为对该质粒在环境中的传播风险评估及氟苯尼考的临床应用提供的参考.(图2表2参18)     

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定环境水样中的15种抗生素

采用固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法,建立了水样中磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类和氯霉素类15种抗生素的同时测定方法.水样经HLB固相萃取柱富集,ACQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱分离,以乙腈和5 mmol·L~(-1)乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱,电喷雾离子源-串联质谱多反应监测模式检测.结果表明,同时测定15种抗生素的线性范围为5—100μg·L~(-1)(相关系数均大于0.997),检出限为2.1—22.0 ng·L~(-1),定量限为6.9—71.8 ng·L~(-1);空白水样在加标水平为5、10、20μg·L~(-1)时,抗生素的回收率为50.1%—109.0%,相对标准偏差为0.4%—8.5%(n=7).用本文建立的方法检测某农业小流域环境水样,发现5类抗生素可被不同程度检出,浓度范围为0.1—106.2 ng·L~(-1).     

顺序注射阻抑动力学光度法测定环境水样中的对苯二酚

在酸性条件下,利用对苯二酚能够阻抑碱性藏花红和溴酸钾反应的原理,联用顺序注射分析技术建立了快速测定环境水样中对苯二酚的新方法。在最佳实验条件下,对苯二酚的线性范围为0.05~1.50μg·m L~(-1),检出限为0.02μg·m L~(-1),完成一次分析循环总的试剂消耗仅为0.125 m L。该方法用于自来水、地表水和河水中对苯二酚的测定,结果与HPLC法所得结果对照,无显著性差异。     

磺胺类耐药菌中抗性基因sul的表达规律

抗生素环境污染是影响抗生素抗性基因传播和扩散的主要因素,然而关于抗生素耐药菌在抗生素暴露下抗性基因的表达机制研究甚少。本研究利用RT-PCR方法检测了土壤中优势耐药菌菌株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis SYN201,G+)和弗氏志贺菌菌株(Shigella flexneri NJJN802,G-)在含有不同浓度磺胺类药物的培养基中生长不同时间后抗性基因(sul 1、sul 2、sul 3)的表达变化。结果发现:无论培养基中是否存在磺胺类药物,菌株SYN201和NJJN802中的3种磺胺类抗性基因均分别在培养的第72小时或36小时出现一个明显的表达峰,而在其他培养时间下不表达或表达量处于相对极低的水平;磺胺嘧啶的存在有助于提高菌株在此特征表达时间下抗性基因的表达水平,与未加磺胺嘧啶组相比,暴露于磺胺嘧啶(60μg·m L~(-1))组的sul 1、sul 2和sul 3在菌株SYN201中的相对表达量分别提高了2.5、4.8和3.2倍,而在菌株NJJN802中的相对表达量分别提高了3.7、6.0和5.0倍。通过将耐药菌暴露于不同磺胺嘧啶浓度下考察sul基因相对表达情况,研究发现随着培养基中磺胺嘧啶浓度的升高(0~1 024μg·m L~(-1)),菌株SYN201和NJJN802中sul基因的表达量整体上呈现出明显的上升趋势。本研究对揭示磺胺耐药菌的抗性表达规律及抗生素暴露对其抗性表达发挥的作用具有重要意义。     

铅和得克隆联合暴露对斑马鱼胚胎的神经毒性作用

以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,探讨铅(Pb)、得克隆(DP)及二者联合急性暴露对斑马鱼胚胎的神经毒性作用。结果表明,Pb(5、20μg·L~(-1))和DP(15、60μg·L~(-1))单独暴露均会引起斑马鱼自主运动频率增加,触摸反应能力和自由游泳活力下降,并且抑制初级运动神经元的生长,加剧尾部细胞凋亡。但与20μg·L~(-1)Pb单独暴露相比,高剂量联合暴露(20μg·L~(-1)Pb+60μg·L~(-1)DP)使斑马鱼的自主运动频率显著降低(P0.05),触摸反应能力和自由游泳活力显著增强(P0.05),初级运动神经元轴突长度显著增加(P0.05),尾部细胞凋亡减少。与5μg·L~(-1)Pb单独暴露相比,低剂量联合暴露(5μg·L~(-1)Pb+15μg·L~(-1)DP)也显著减少斑马鱼尾部的细胞凋亡(P0.05)。上述结果表明,Pb或DP单独暴露对斑马鱼均可引起神经毒性作用;但二者联合暴露对斑马鱼自主运动、触摸反应以及自由游泳活力的影响则表现为拮抗作用。     

天津地区环境持久性药物污染物残留水平调查

针对环境持久性药物污染物(EPPPs)的污染问题,采用固相萃取-高效液相色谱/串联质谱法,调查分析了22种环境持久性药物污染物在天津地区水体和沉积物中的残留水平和分布特征。结果显示,水源地水样中有19种EPPPs的检出率为100%,质量浓度范围为0.21～0.69μg·L~(-1),平均值为0.43μg·L~(-1)。地表水样中,除吉他霉素检出率为80%外,其余21种EPPPs的检出率均为100%,质量浓度范围为0.52～3.88μg·L~(-1),平均值为1.60μg·L~(-1)。沉积物样中共检出11种EPPPs,检出率为100%,含量范围为0.04～1.10μg·kg~(-1),平均值为0.52μg·kg~(-1)。其中蓟县于桥水库、蓟运河滨海新区段水样和独流减河滨海新区段沉积物样中检出的EPPPs残留水平较高,水体中环丙沙星、诺氟沙星与菲诺洛芬检出浓度较高,沉积物中则为吲哚美辛、水杨酸及氟苯尼考。对比国内外其他地区,天津地区水环境中EPPPs残留处于较高水平。