生物制氢最新研究进展与发展趋势

氢能具有清洁、高效、可再生的特点,是一种最具发展潜力的化石燃料替代能源.与传统的热化学和电化学制氢技术相比,生物制氢具有低能耗、少污染等优势.近年来,生物制氢技术在发酵菌株筛选、产氢机制、制氢工艺等方面取得了较大进展.暗发酵和光发酵结合制氢技术是一种新技术,具有较高的氢气产量.以厌氧细菌和光合细菌为发酵菌种,以富含碳水化合物的工农业废弃物为原料,进行暗发酵和光发酵结合制氢,具有广阔发展前途前景.本文综述了国内外生物制氢技术研究进展,展望了未来发展趋势.     

原生质体融合构建高产碱性蛋白酶工程菌

用原生质体融合的方法，将碱性蛋白酶生产菌2709与含有碱性蛋白酶基因克隆载体pDW2的工程菌枯草杆菌BD105进行细胞融合，得到1株高产碱性蛋白酶的工程菌A16，菌落的原位杂交表明，该菌株携有双亲的遗传物质，A16的表型与生长特征与2709相似，但同样条件下发酵酶活比2709高50%-100%，摇瓶发酵的产酶水平最高可达30000u/mL,A16发酵所产酶的最适pH与耐温性及发酵条件等特征均与2709相同。适用于工业生产。     

利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展

要实现木质纤维素类生物质的有效利用,当前还面临很多瓶颈问题亟待解决,而缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物的发酵菌株是制约纤维素乙醇生产的最关键因素.目前对发酵菌种的研究主要集中在酿酒酵母、运动发酵单胞菌、大肠杆菌和克雷白氏杆菌这4种菌上,已取得大量研究进展,为纤维素乙醇的产业化奠定了一定的基础.本文综述了这4种菌发酵纤维素水解物的基因工程改造研究进展,并对组学时代进一步优化发酵菌株进行了展望.图2表2参51     

嗜酸性氧化硫硫杆菌的分离鉴定及其产酸特性

嗜酸性氧化硫硫杆菌是生物淋滤技术去除污泥中重金属的主要菌种,其生物氧化产酸反应是生物淋滤的关键步骤。为筛选、培育出高效的嗜酸性氧化硫硫杆菌。通过研究氧化硫硫杆菌的产酸特性,找出提高其产酸效果的方法,筛选、培育出高效的嗜酸性氧化硫硫杆菌。本研究从某污水处理厂活性污泥中分离、纯化得到一株高效氧化单质硫的菌株JJU-1,通过菌株和菌落形态观察、生理生化试验、16S r DNA序列分析和同源性比较等分析方法,鉴定该菌株为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidan),并从初始p H值、硫粉投加量、单质硫粒度、吐温60浓度等4个方面对JJU-1菌株的产酸特性进行了研究。实验结果表明:培养液初始p H值对后期产酸性能影响较小,当培养到第7天时,各培养液的p H值基本处于同一水平,但初始p H值小于1时,菌株的生长受到抑制;硫粉投加量越大,菌株产酸效率越高,当培养到第8天时,不同硫粉投加量的培养液p H值最大差值达到0.54;菌株产酸速率随单质硫粒度的减小而增大,粒径小于180μm的硫粉比大于180μm的硫粉产酸速率快;吐温60的投加对氧化硫硫杆菌产酸有一定的影响,当吐温60的浓度为0.4~1.6 g·L-1时,对氧化硫硫杆菌产酸有一定的促进作用,但当吐温60的浓度大于2.0 g·L-1时,培养8 d后氧化硫硫杆菌的生长受到一定的抑制;微滤膜实验表明JJU-1菌株与单质硫表面的直接接触是发生产酸反应的先决条件。在最佳生长条件(初始p H=2.5~3.5、θ=28~32℃)下,JJU-1菌株培养5 d后,培养液p H值从3.5降到1.5左右,由此可见,该菌株具有良好的氧化单质硫产酸性能,在污泥生物淋滤技术中具有一定的应用前景。     

蓝藻发酵生产微生物农药的影响因素研究

采用摇瓶发酵试验探讨了蓝藻为原料制备苏云金杆菌生物杀虫剂的可行性,并考察了不同培养条件（蓝藻含固率、种龄、接种量、初始pH、摇床转速、发酵温度）对苏云金杆菌生长增殖、产孢与产毒效果的影响。研究结果表明,无需任何预处理工序,Btk 130菌株能在蓝藻为唯一原料的培养基中正常生长发育,并且产孢产毒。发酵48 h后,芽孢产率达到86.7%,远高于常规培养基;生物毒效为282 IU.mL-1,与常规培养基相当。培养条件优化结果表明,在蓝藻含固率为2%、初始pH为7.0、接种物种龄为9 h、接种量为2%、培养温度为30℃、摇瓶转速为200 r.min-1的条件下培养48 h,Btk 130可达到较好的发酵效果,活菌数及抗热芽孢数可达7.32 CFU.mL-1和6.38 CFU.mL-1,生物毒效为528 IU.mL-1。该研究不仅为蓝藻提供了高附加值的处置新途径,而且可显著降低生物杀虫剂的生产成本,具有广阔的应用前景。     

微生物转化淀粉废水制备生物灭蚊剂

采用摇瓶发酵试验探讨了淀粉废水为原料制备微生物灭蚊剂的可行性.结果表明,无需任何预处理工序,淀粉废水可作为微生物灭蚊菌株(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis 187菌株和Bacillus sphaericus 2362菌株)的优良发酵培养基.Bti 187和Bs 2362菌株能在淀粉废水(含固率2.5%)为唯一原料的培养基中正常生长发育,并且产孢产毒.Bti 187和Bs 2362在淀粉废水发酵42 h,活菌数分别可达7.5×108、4.5×108 CFU·mL-1;抗热性芽孢数分别可达5.1×108、2.7×108 CFU·mL-1,均显著高于常规LB培养基.与LB培养基相比,淀粉废水培养基有利于提高芽孢产率、缩短发酵周期.毒力测定表明,淀粉废水培养42 h的Bti发酵液对淡色库蚊和白纹伊蚊的LC50分别为0.78、0.87 μg·mL-1,淀粉废水培养42 h的Bs发酵液对淡色库蚊和白纹伊蚊的LC50分别为0.70、16.06 μg·mL-1,淀粉废水明显有利于Bti 187与Bs 2362菌株的产毒.本研究不仅为淀粉废水提供了高附加值的处置新途径,而且可显著降低生物灭蚊剂的生产成本,具有广阔的应用前景.     

苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂发酵生产的影响因素及其工艺选择

化学杀虫剂的长期使用给生态环境造成了严重破坏,也使害虫种群的抗药性日益提高,生物杀虫剂以其＂绿色环保＂的特点引起人们的广泛关注。其中,苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）制剂是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。它对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、螨类等许多有害昆虫有毒杀作用,而对人类、动物和农作物无害。长期以来,人们一直致力于苏云金芽孢杆菌发酵过程的研究,以期获得高毒效的生物杀虫剂产品。本文首先对苏云金芽孢杆菌发酵生产的各种影响因素进行了综合分析,将影响因素分为培养条件和培养基组分两类,得出最佳培养条件为温度：（30±1）℃,pH：7.0±0.1,搅拌速度：400～600r·min-1,通气量：1∶0.6～1.2（发酵培养基体积与每分钟通入空气的体积之比）,接种时间：对数期初;最佳培养基配比为碳氮比：8～10∶1,无机盐含量：KH2PO4或K2HPO4为0.075%～0.2%;MgSO4·7H2O为0.075%～0.3%;CaCO3为0.075%～0.15%;MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O各为0.002%。其次,对当前研究与工业化生产中的各种发酵工艺进行了评述,总结了现有发酵工艺的优缺点。在现有研究基础上,降低培养基原料成本、改进发酵工艺和采用基因学手段构建高效工程菌株将成为未来研究热点。     

Clostridium papyrosolvens厌氧发酵产氢研究

采用分批培养研究了从高浓度厌氧产氢活性污泥中筛选的优势菌种Clostridium papyrosolvens的发酵产氢能力.结果表明:该菌有较强的高糖耐受性和耐酸性,当葡萄糖浓度为30 g/L、pH阶段性控制在4.5时,发酵44 h葡萄糖消耗率为83.7%,总产气量达到3 081.3 mL/L,最高产气率为187.5 mL L-1 h-1,氢气含量为67.5%,比产氢率达1.06 mol(H2)/mol(葡萄糖).研究中选用了廉价的发酵产氢培养基,以玉米浆为氮源,以还原铁粉作氧化还原电位控制剂,省去了牛肉膏、蛋白胨等昂贵氮源以及L-半胱氨酸、维生素、无机离子等高成本组分,显著降低了纯菌发酵的培养基成本,获得了较好的产氢效果.图5表2参23     

抗真菌多肽捷安肽素发酵条件的研究

对筛选出的一株芽孢杆菌ZK发酵产物抗真菌多肽捷安肽素的发酵培养基组分(碳源、氮源及无机盐)和工艺条件(发酵温度、起始pH,摇床转速,装液量)进行了摸索,通过单因素实验和正交优化实验,确定了ZK菌株发酵培养基最佳组成:生物氮素3.5％、葡萄糖3％、酵母膏0.08％、MgSO4·7H2O 0.5％、KH2PO4·3H2O 0.1％;最适温度为32℃;最适初始pH为8.0.在250 mL三角瓶中装50 mL培养基,于150 r min-1的旋转摇床上32℃振荡培养72 h,ZK菌株产捷安肽素的量达到最大.图8表5参14     

产纤维素酶菌株的选育分析及发酵工艺优化

对实验室6株产纤维素酶菌株进行酶活特性研究.首先通过观察纤维素平板的酶溶解透明圈大小进行初步分析,比较6株菌种子发酵液中纤维素酶含量.再根据不同种纤维素酶作用的底物化学键的不同,分别测定菌株的滤纸酶活(FPA)、纤维素内切葡聚糖酶(CMCase)活、纤维素外切葡聚糖酶(CBH)活和β-葡萄糖苷酶酶活,发现菌株中黑曲霉的各产酶指标均高于其它菌株.根据Box-Behnken原理对黑曲霉发酵工艺进行优化设计,得到最适碳源稻草粉含量9.47 g.L-1、麸皮含量49.33 g.L-1,氮源中(NH4)2SO4含量为2.0 g.L-1,发酵后黑曲霉产生的滤纸酶活力达到76.72 U.mL-1,比优化前酶活力提高88.69%.     

高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及酶学、转酯特性

从自然环境中筛选水解酶活高且酶学、转酯特性优良的产脂肪酶菌株,对脂肪酶工业化发酵生产及生物柴油制备的研究具有重要意义.采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法,从70份含油脂丰富的样品中筛选产脂肪酶酶活较高的菌株进行16S rRNA鉴定,研究其酶学性质;用大孔树脂固定酶,在无溶剂体系中催化橄榄油制备生物柴油,研究其转酯特性.结果筛选到一株高产脂肪酶的菌株WZ10-3,通过p-NPP法测得其初始酶活为78.68 U/mL,经16S rRNA鉴定属于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.),与B.stabilis同源性达到99%.该菌在发酵48 h时达到产酶高峰,所产脂肪酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为7.0,70℃下的半衰期可达1 h,pH为7-9时稳定性良好.以大孔树脂NKA-9和HPD600为载体制备的2种固定化脂肪酶,催化橄榄油生产生物柴油的转酯率均可达到97%.综合表明,菌株WZ10-3脂肪酶的初始水解酶活高于大多数野生脂肪酶,热稳定性好且转酯特性优良,有很好的后续研究价值.图7表3参25     

温度和溶菌酶敏感菌株的L-谷氨酸合成

用温度敏感型菌株发酵生产L-谷氨酸不存在生物素亚适量问题,因此该方法在国际上被广泛使用.通常采用对出发菌株进行传统诱变的方法获得温度敏感型菌株.以谷氨酸棒杆菌CICC 10226为出发菌株,先克隆其ItsA基因,然后通过基因敲除的方法构建了突变菌株Corynebacterium glutamicum WT ΔL,该菌株同时具有温度敏感性和溶菌酶敏感性.经透射式电子显微镜观察发现,于38℃培养的突变株细胞与在30℃培养的同一种细胞相比,细胞明显增大,而出发菌株无该现象.发酵试验表明,在生物素过量的情况下,在发酵进入细胞产酸期后通过将发酵温度从原来的30℃提高到38℃,温度敏感突变株的产酸量增加近5倍.如果在发酵培养基巾添加适量的琥珀酸和乙酸,该菌株与不添加的在30℃培养的对照相比,产酸量增加近6.5倍.对于野生型出发菌株而言,在生物素过量的情况下,无论是否采用变温发酵方法都几乎不产酸.说明温度敏感突变株即使在生物素过量的情况下也能通过变温发酵诱导其合成并分泌产生L-谷氨酸.图10表1参13     

产电微生物基因组及代谢网络分析

产电微生物的生物信息学分析是微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell,MFC)研究中的关键环节,各种生物信息学分析方法已经开始应用于产电微生物研究.本文综述了目前产电微生物基因组、功能基因组和代谢网络分析的重要方法,包括基因和基因表达信息分析、基因组和比较基因组分析、代谢网络建模和计算机模拟等,其中,产电微生物代谢网络的构建是联系上游基因组分析和下游基因工程改造的关键,是目前相关研究面临的挑战.生物信息学分析必将促进干实验与湿实验的紧密结合,促进发现电子转移相关功能基因,解析微生物产电机制,优化代谢网络,由此指导基因工程改造产电微生物,最终提高产电效率.     

CO厌氧发酵制氢过程中的微生物特性及其影响因素

以发酵液中溶解的一氧化碳(CO)为底物,研究高温嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)厌氧发酵制氢的工艺过程.通过C.hydrogenoformans菌的生长规律、絮凝能力和反应特性等实验研究,建立菌株的生长规律模型,得出微生物衰减系数和最大比生长速率.结果表明,C.hydrogenoformans菌产氢率高,絮凝效果好,用于连续CO生物发酵制氢工艺是可行的.对发酵制氢过程的影响因素进行考察,得出最佳食微比及CO对发酵制氢过程的抑制浓度等过程参数,为有效开发CO厌氧生物发酵制氢的工艺路线提供了参考依据.图4表2参17     

牛粪生物质资源综合利用研究进展

畜禽粪便是一种重要的廉价生物质资源,含有丰富的木质纤维素和矿质营养,但随意堆弃必然会对环境形成污染,同时造成资源浪费.为促进实现畜禽粪便的循环再生利用,从牛粪肥料化利用、能源化利用和化学品生产原料3个方面综述牛粪生物质资源的研究进展,分析不同处理方式对牛粪利用效率的影响.肥料化利用在一定程度上能消解环境中的牛粪,但因生产成本高、资源利用率低等问题限制了其大规模推广.而牛粪厌氧发酵能产生清洁能源沼气,结合厌氧共发酵方式可以提高甲烷产率,并且发酵后的沼液可用于浸种和生物农药利用;同时牛粪可以作为制取乙醇的新型原料,通过分子生物学手段构建重组运动发酵单胞菌,扩大菌株的底物利用范围.此外,牛粪作为乳酸、富马酸、纤维素等生物基产品的生产原料,丰富了牛粪利用方式.最后提出在牛粪利用过程中加强对重金属和抗生素的脱除,着力研究沼气工程建设技术,稳定发酵温度,提高产率,同时构建糖利用范围广、乙醇得率高的菌株,发展多重牛粪利用方式,以实现牛粪生物质资源的高值高效利用.     

一株耐盐嗜热菌Aneurinibacillus thermoaerophilus H7的分离及其油脂降解特性

针对高盐、高油餐厨垃圾高温堆肥功能菌株缺乏的问题,以大豆油为唯一碳源,通过测定生物量、脂肪酶活性和油脂降解率,从餐厨垃圾堆积处的土壤样品中分离筛选出一株嗜热油脂降解菌H7.通过形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,对筛选的菌株进行鉴定,考察其耐盐能力、油脂降解和生长特性.结果表明,菌株H7为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus),最高耐盐浓度为30 g/L.菌株H7在油脂浓度为15 g/L的发酵培养基中发酵72 h,油脂降解率为60.11%,菌体浓度OD600为1.88,脂肪酶活性为11.65 U/mL.菌株H7可生长的温度为40-60℃,pH值为5-8,摇床转速为120-240 r/min,最适生长的温度为50℃,pH值为6,摇床转速为220 r/min.本研究获得了具有耐盐性和能降解高浓度油脂的嗜热菌株H7,可为高盐高油脂含量的餐厨垃圾堆肥提供微生物菌种资源.(图8表2参34)     

微生物育种技术在废水处理工程菌株研制中的应用

随着环境污染的日益严重,仅靠从自然环境中分离筛选有降解酶活菌株的方法已不能适应废水处理实践的要求,需要应用先进的微生物育种技术来更加快速而定向地制备降解工程菌株并用以组成高效的废水生物处理系统.本文从细胞和分子生物学水平综述了国内外应用微生物育种技术研制环保工程菌的部分理论研究进展和应用概况,对各种育种方法的利弊及目前研究中尚存的问题也作了探讨.     

工业酿酒酵母菌株KF-7对发酵抑制物的耐受性

木质纤维素原料预处理过程中产生的抑制物是燃料乙醇发酵的一大障碍,要求工业酿酒酵母菌株具有优秀的抑制物耐受能力.利用平板培养和批次发酵两种方式系统评价了弱酸抑制物(乙酸、甲酸、乙酰丙酸)、呋喃类抑制物[糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)]、酚类抑制物(香草醛、丁香醛、苯酚)对工业酿酒酵母菌株KF-7生长和发酵的影响.结果显示,菌株KF-7在批次发酵时细胞生长对抑制物的耐受性优于平板培养.低浓度的抑制物虽然对菌株的生长有一定的抑制作用,但对乙醇的产生具有一定的促进作用;高浓度抑制物显著抑制了菌株的生长,降低了葡萄糖的代谢速率,抑制了乙醇的产生.菌株KF-7对甲酸耐受能力强于乙酸,对乙酰丙酸的耐受能力较弱.在平板生长评价中,糠醛对菌株生长的抑制作用强于HMF,但在批次发酵过程中HMF的抑制作用强于糠醛;该菌株代谢糠醛的能力强于代谢HMF的能力.香草醛对菌株的抑制作用最强,丁香醛相对较弱.在秸秆水解液中,菌株KF-7也表现出良好的乙醇发酵性能.菌株KF-7无论在单一抑制物、混合抑制物或实际水解液条件下发酵,均能达到较高的乙醇收率.本研究表明,菌株KF-7适用于纤维素原料燃料乙醇工业化生产过程.     

运动发酵单胞菌共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶发酵甘薯生产乙醇

运动发酵单胞菌是乙醇发酵的极佳菌种,但其所能利用的发酵底物范围狭窄,不能利用淀粉作为发酵底物.为增加其利用底物的范围使其能够水解淀粉,本研究构建了3种表达淀粉酶的运动发酵单胞菌菌株:1)Zymomonas mobilis(pAmyE)表达α-淀粉酶;2)Z.mobilis(pGA)表达葡萄糖淀粉酶;3)Z.mobilis(pAmyGA)共同表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶.DNS法测定淀粉酶活显示,每种转化菌株的胞外淀粉酶活性均高于胞内,且两种淀粉酶共表达的酶活高于这两种淀粉酶单独表达的酶活之和,说明这两种淀粉酶能够协同作用降解淀粉.对于重组菌株Z.mobilis(pAmyGA),约59.3%的淀粉酶活性都在胞外检测到.用淀粉含量高且耐贮存的徐薯18匀浆加少量葡萄糖作为培养基直接用上述3个菌株发酵生产乙醇.结果显示,共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的重组菌株Z.mobilis(pAmyGA)的乙醇产量为54.7 g/L,达到了理论值的83.2%,表明本研究得到了能够直接高效利用淀粉生产乙醇的运动发酵单胞菌的菌株.     

微生物发酵生产γ-聚谷氨酸研究进展

天然存在的高分子生物聚合物γ-聚谷氨酸(γ-PGA)因具生物可降解性、无毒性和非免疫原性而被广泛应用于食品、工业和医疗等领域,主要由微生物发酵制备;当前γ-聚谷氨酸的微生物发酵制备技术在我国基本上处于实验室研究阶段,距离大规模的工业化生产还有很大差距.综述γ-聚谷氨酸的高产菌株选育,包括分离筛选新的γ-PGA生产菌株以及对原有的菌株进行遗传诱变和基因操作、合成机制;发酵条件优化,包括对培养基的组成成分(碳源、氮源和金属离子等)和发酵因素(温度、pH和溶氧等)进行优化;发酵方式选择,包括常规的液体发酵方式以及以工农业废弃物为原料的固体发酵方式;分离方法的建立,包括有机溶剂沉淀法和金属离子沉淀法的比较等.最后对γ-PGA相对分子质量的调控、生产成本、分离纯化、具体合成机制和大规模生产进行展望,以期为γ-聚谷氨酸工业化生产及在我国进一步的推广应用提供理论支撑.