斜带石斑鱼alpha型与rho型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究II相去毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)等海水鱼类机体内代谢去毒过程中的作用及机制,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到斜带石斑鱼肝脏alpha-GST(GSTA)、rho-GST(GSTR)基因cDNA全序列.序列分析结果表明,斜带石斑鱼肝脏GSTA基因cDNA全长1008bp,编码223个氨基酸;GSTR基因cDNA全长1002bp,编码225个氨基酸.构建系统进化树发现,斜带石斑鱼与鲤鱼、斑马鱼GSTA氨基酸同源性较高,而GSTR为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有所有类型同源性均较低.     

真鲷去毒相关基因cDNA序列的克隆与肝脏组成型表达分析

赤潮发生时产生的一些海洋生物毒素对人类和海洋动物的安全形成潜在的威胁甚至导致死亡.为从分子水平探讨鱼类中海洋藻毒素的去毒分子机理,采用RT-PCR法克隆了真鲷(Pagrus major)肝脏芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)和I时相异生素代谢酶细胞色素P4501A(CYP1A)基因cDNA核心序列,同时,应用半定量RT-PCR方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在其指数期增长的范围内研究了芳香烃受体(AHR)、ARNT、CYP1A、II时相异生素代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA1、GSTA2)、rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70(HSP70)基因组成型表达水平.结果发现,真鲷ARNT、CYP1A基因cDNA核心序列片段分别长438bp和908bp,分别编码146和302个氨基酸.序列同源性分析发现,真鲷与门齿鲷(Stenotomus chrysops)、石首鱼(Micropogon undulatus)ARNT基因氨基酸序列同源性高达97.2%、95.2%,与斑马鱼(Brachydanio rerio)、人、大鼠、小鼠ARNT同源性较低(77.2%～79.3%).真鲷与门齿鲷、金头鲷(Sparus auratus)、欧洲川鲽(Rhombus maximus)、欧洲海鲈(Dicentrachus labrax)CYP1A基因氨基酸序列同源性较高,为84.8%～94.0%,与斑马鱼、人、小鼠CYP1A同源性较低,为59.6%～77.8%.真鲷肝脏AHR、ARNT、CYP1A、GSTA1、GSTA2、GSTR和HSP70基因组成型表达水平分别为(25.32±6.56)%、(26.22±4.24)%、(146.5±16.06)%、(55.42±3.75)%、(48.82±10.89)%、(79.47±3.13)%、(107.42±14.34)%.     

近江牡蛎4种类型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究不同类型谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因在近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)等贝类体内代谢去毒过程中的作用,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到近江牡蛎肝脏4种类型GST基因cDNA全序列.序列分析结果表明,mu、pi、omega、sigma4种类型GST基因cDNA全长分别为970bp、773bp、999bp、1277bp,分别编码215、207、242、203个氨基酸.构建系统进化树发现,除太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)pi型GST外,所有类型GSTs序列都能各自聚集成一簇.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因b-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列. 结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸. 实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列. 所获基因与其它动物类群的b-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物b-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守. 系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因β-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列.结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸.实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列.所获基因与其它动物类群的β-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物β-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守.系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

水稻arf1基因3′-UTR片段的克隆和验证

终止子是一段位于基因编码之后的序列,作为一种调控信号调控DNA的转录终止和RNA的释放,在基因工程技术应用中通常被构建在目的基因下游,用以调控基因的转录和表达.现有常用的终止子很少,克隆和验证新的终止子是植物基因工程技术发展的需要.通过生物信息学分析和Realtime-PCR表达验证,筛选出候选基因腺苷酸核糖基化作用因子(Similar to ADP-ribosylation factor1,arf1)基因,克隆了水稻arf1基因3′-UTR.结果显示,所克隆3′-UTR片段含有8个多聚信号元件和4个UE片段.将3′-UTR与gus基因融合后分别与玉米泛素启动子Ubiquitin和花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子35S连接构建植物表达载体验证3′-UTR调控表达效果.烟草瞬时表达显示3′-UTR融合的gus基因在35S和Ubi启动子驱动下,在烟草叶片中能正常表达;3′-UTR调控下的gus基因在水稻根、茎、叶、花和种子中均可稳定表达,且表达量与T-Nos终止子相当.本研究表明所克隆的3′-UTR可替代T-nos终止子,可为植物基因工程技术的应用提供新的调控元件.(图5表3参29)     

四膜虫omc基因的克隆及在滴滴涕(DDT)暴露下的表达分析

针对环境激素类污染物滴滴涕(DDT)危害大和分子机理复杂等问题,以之前筛选出的一个DDT暴露下差异表达的基因——酮戊二酸/苹果酸载体蛋白基因(2-oxoglutarate/malate carrier,omc)为研究对象,克隆得到该基因转录mRNA的全长为1060bp,其中5′、3′非翻译区分别为46bp和99bp;实时定量PCR方法测定不同浓度DDT暴露下该基因的表达水平下降了20%～50%.四膜虫omc基因上游数个AP-1和NF-kappaB位点的存在,提示该基因表达受DDT调控的模式可能是与高等动物类似的雌激素受体间接调控途径;同时根据omc基因存在多个与三羧酸循环和电子传递链相关的共表达基因的结果推测,DDT可能通过调控omc等基因来影响线粒体正常功能,进而对细胞产生毒害作用.图3表1参28     

全基因合成方法学研究

通过基因全合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段,因此,建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要.本研究报道了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法.此方法包含经DNA2.0软件的序列优化,Gene2Oligo软件的寡核苷酸设计,覆盖全长基因双链的寡核苷酸的组合和引物介导下的全基因的合成等步骤.运用此方法,对3个不同长度的基因(分别为653bp,1309bp和1498bp)成功地进行了密码子优化和一步全合成.其中的amyFF在大肠杆菌中表达量提高了12倍.图2参18     

D.radiodurans kat A和kat B基因的结构分析与功能鉴定

以简并引物PCR获得的Cat酶基因片段探针，结合生物信息学方法，探明了耐辐射奇球菌（D.radiodu-rans)基因组中存在两个编码过氧化氢酶（Catalase,Cat)的基因：katA和B.katA和katB基因长2277bp和1611bp，各编码758和536个氨基酸，用pKK223-3表达载体连接katB基因，转入Cat酶缺陷型大肠杆菌（E. coliUM2)进行表达.katB基因表达产物具有Cat酶活性，电泳迁移位置与D.radiodurans CatB酶位置相符，并可重建E.coliUM2对低浓度H2O2损伤的耐受力。     

HvABA8′OH-1基因RNAi载体的构建及遗传转化

穗发芽严重影响作物的产量和品质,种子休眠性弱是穗发芽形成的主要原因之一.ABA是维持胚休眠抑制萌发的重要激素,大麦HvABA8′OH-1基因编码控制内源ABA主要分解代谢途径的关键酶.以双元载体pGreenⅡ为骨架载体,分别选取HvABA8′OH-1的保守区序列(293bp)和特异区序列(474bp),水稻胚乳特异性启动子pGlub,成功构建了种子特异性RNA干扰表达载体pOHC和pOHS.利用农杆菌介导法将载体转入水稻,获得植株50株.经鉴定,其中18株为转基因阳性植株.研究结果为进一步分析HvABA8′OH-1基因的生物学功能,以及通过基因工程途径建立作物抗穗发芽育种新方法提供了理论依据和材料.     

斑马鱼p53基因结构比对分析及其在生态毒理学中的应用

斑马鱼p53基因由11个外显子和10个内含子组成,外显子1和外显子11部分序列不参与编码蛋白质．其 cDNA核苷酸序列共2089bp,包含一个1122 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)(44 bp-1165 bp),这个 ORF编码373个氨基酸．另外在3’端有924 bp是非翻译区(3’-UTR),5’端同样也存在43 bp的非翻译区(5’- UTR);12种脊椎动物p53氨基酸序列的保守性分析结果表明,在一些特殊的区域,12种氨基酸序列表现出了很高的保守性,这些区域和p53的抑癌功能密切相关．研究结果预示斑马鱼p53基因是一种理想的环境致突变物研究分子模型,在生态毒理学研究中具有良好的应用前景．     

Co-existing populations of Pacific ocean perch, Sebastes alutus, in Queen Charlotte Sound, British Columbia

Variation at five microsatellite loci (Sal1, Sal2, Sal3, Sal4 and Sal5) was examined in approximately 1300 Pacific ocean perch (Sebastes alutus) sampled from 14 coastal sites in British Columbia, Canada. Mean observed heterozygosities by locus ranged from 71% to 88%, and by sample ranged from 75% to 84%. Theta values ranged from 0 to 0.04 over the five loci, and averaged 0.015. Among Pacific ocean perch samples, Š ranged from 0.001 to 0.056. Canonical discriminate analysis of multilocus genotypes and neighbour-joining analysis of pairwise genetic distances between samples both indicated the presence of three populations, one off the west coast of Vancouver Island (the Vancouver Island population) and two co-existing populations in Queen Charlotte Sound, Dixon Entrance and along the west coast of the Queen Charlotte Islands (the eastern and western QCI populations). Pacific ocean perch of the eastern and western QCI populations were caught in close proximity to each other, but individual samples showed little evidence of admixture. Fall and spring samples collected within geographic areas were genetically similar, indicating seasonally stable population structure. Restricted gene flow between the Vancouver Island and the two more northerly populations may result from limited adult dispersal and larval retention within the California Current and Alaska Gyre, respectively, but the presence of two populations within Queen Charlotte Sound cannot be explained entirely by larval retention hypotheses. The presence of two Pacific ocean perch populations in central British Columbia has implications for fisheries management.     

Gizzard shad put a freeze on winter mortality of age-0 yellow perch but not white perch.

Four decades of observations on the limnology and fishes of Oneida Lake, New York, USA, provided an opportunity to investigate causes of mortality during winter, a period of resource scarcity for most juvenile fishes, in age-0 yellow perch (Perca flavescens) and age-0 white perch (Morone americana). This time series contains several environmental (e.g., winter severity) and biological (e.g., predator abundance) signals that can be used to disentangle multiple effects on overwinter mortality of these fishes. A multiple regression analysis indicated that age-0 yellow perch winter mortality was inversely related to fish length in autumn and to the abundance of alternative prey (gizzard shad [Dorosoma cepedianum] and white perch). However, no length-selective predation of yellow perch by one of the main predators, adult walleye (Sander vitreus), was detected. In contrast, white perch mortality was directly associated with total predator biomass and abundance of white perch in autumn, and inversely related to yellow perch abundance as a potential buffer species, but not to the abundance of gizzard shad. Winter severity was not a significant predictor of mortality for either perch species. Predicted winter starvation mortality, from a model described in the literature, was much lower than observed mortality for yellow perch. Similar models for white perch were correlated with observed mortality. These results collectively suggest that predation is the main mechanism shaping winter mortality of yellow perch, while both predation and starvation may be important for white perch. This analysis also revealed that gizzard shad buffer winter mortality of yellow perch. Although winter duration determines the northern limit of fish distributions, in mid-latitude Oneida Lake and for these species, predator-prey interactions seem to exert a greater influence on winter mortality than starvation.     

团头鲂谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及其在氨氮胁迫中的表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类多功能蛋白家族,主要参与解毒和抗氧化防御过程。为了研究GST在团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏解毒过程中的作用,克隆并分析了团头鲂1个谷胱甘肽S-转移酶基因(命名为MaGST)cDNA序列,采用实时荧光定量PCR研究了其在氨氮胁迫下的表达规律。MaGST包含1个长218个氨基酸的完整开放阅读框,具有GST蛋白家族的保守碱基和保守结构域。通过MEGA 5.0软件分析系统进化树发现,团头鲂GST与其他动物mu型GST聚为一簇,表明团头鲂GST属于mu型GST。荧光定量PCR结果显示MaGST基因在团头鲂各组织中均有表达,在肝脏和鳃中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在氨氮胁迫过程中该基因在肝和鳃中的表达规律相似,均在胁迫期间表达量显著上调;氨氮胁迫24 h时鳃和肝组织均存在组织损伤。研究结果提示在团头鲂肝脏和鳃组织中GST基因参与了氨氮胁迫的解毒过程。将该基因的编码区重组到p ET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达,重组MaGST的GST活力为(10.36±0.68)U·mg~(-1)蛋白。     

粗壮女贞中的新单萜配糖体

从粗壮女贞（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｒｏｂｕｓｔｕｍ）叶子中分离鉴定了４个新的单萜配糖体,命名为粗壮女贞甙Ｄ、Ｇ、Ｈ和Ｌ．通过滤谱及化学方法,它们分别鉴定为香叶醇３‘－Ｏ－μ－Ｌ－南鼠李糖基－４’－顺式香豆酰基－β－Ｄ－吡喃葡萄糖甙（１）,６－羟基－３,７－二甲基－２Ｅ,７葵二烯醇３‘－Ｏ－α－Ｌ－吡喃鼠李糖基－４’反式香豆酰基－β－Ｄ－吡喃葡萄糖甙（２）,６－羟基－３,７－二甲基－２Ｅ,７－葵二烯醇     

Cloning,expression, and functional identification of CaSWEET7 and CaSWEET15 genes in Canarium album北大核心CSCD

糖外排转运蛋白(sugars will eventually be exported transporters,SWEET)介导植物光合同化产物蔗糖的跨膜运输.以橄榄(Canarium album(Lour.)Raeusch.)果实为材料,通过气相色谱串联质谱(GC-MS)检测橄榄果实中糖组分及含量变化,利用RT-PCR技术克隆得到CaSWEET7和CaSWEET15基因开放阅读框(ORF)序列.结果表明:CaSWEET7和CaSWEET15基因ORF全长分别为774 bp和951 bp,分别编码长度为257个和316个氨基酸残基,具有2个MtN3_slv结构域;进化树分析表明,CaSWEET7属于CladeⅡ,CaSWEET15属于CladeⅢ.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同发育时期的果实中相对表达量变化,结果表明,随着果实发育,CaSWEET7和CaSWEET15表达量逐渐递增,且与果实发育蔗糖含量变化呈显著正相关(相关性系数分别为0.931和0.904,P<0.05);利用酵母功能互补证明CaSWEET7和CaSWEET15基因编码的蛋白具有转运蔗糖能力.本研究表明CaSWEET7和CaSWEET15基因可能在橄榄果实蔗糖积累中发挥作用.(图9表2参44)     

高锰酸钾对中国花鲈的毒性效应

为给中国花鲈(Lateolabrax rnaculatus)养殖的病害防治提供理论数据,研究了高锰酸钾对中国花鲈鱼苗和幼鱼急性毒性,检测了暴露于不同质量浓度高锰酸钾中,幼鱼肝脏的谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活力.结...