五氯酚暴露诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡相关基因的变化及caspase-2基因克隆和系统进化分析

应用基因芯片技术研究发现,暴露于五氯酚的斑马鱼胚胎中有14个涉及细胞凋亡行为的基因表达发生了显著改变.利用生物信息学方法构建这些功能基因系统进化树,分析与环境毒物诱导的细胞凋亡行为密切相关的caspase-2基因和其他基因之间的同源关系.斑马鱼caspase-2基因由10个外显子和9个内含子组成,cDNA长1308bp,含一个开放阅读框(ORF),编码435个氨基酸.6种脊椎动物Caspase-2氨基酸序列的保守性及系统进化分析结果表明,在特定功能区结构域中氨基酸序列表现出较高的同源性,Caspase-2在进化上高度保守.利用RT-PCR技术,斑马鱼caspase-2基因cDNA被克隆并确认.研究结果表明斑马鱼caspase-2基因是一个研究细胞凋亡行为的模型分子,可为环境化合物的分子毒性评价及其机制研究提供一种分子标记。     

全氟辛烷磺化物(PFOS)诱导斑马鱼胚胎p53基因的点突变

将斑马鱼胚胎于0μg·1-1(空白对照),5μg·l-1,16μg·l-1和50μg·l-1全氟辛烷磺化物(PFOS)溶液中暴露染毒5h,采用变性高效液相色谱方法对PCR扩增的含斑马鱼胚胎p53基因外显子7的173 bp的目标片段进行突变分析.结果显示,16μg·l-1和50μg·l-1两个处理组与对照组相比均有显著性差异,表明PFOS可以诱导斑马鱼胚胎p53基因外显子7的点突变.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因b-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列. 结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸. 实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列. 所获基因与其它动物类群的b-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物b-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守. 系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆

促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一是蔗糖合成酶,它也是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶.以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶(Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S.E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%,推导的氨基酸序列同源性达到100%.该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3'不翻译区等,开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr,为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因β-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列.结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸.实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列.所获基因与其它动物类群的β-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物β-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守.系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

一种羟胺氧化酶基因序列的PCR扩增及其生物信息学分析

采用PCR法获得不动杆菌Acinetobactor sp.YY-5的一种羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidoreductase,HAO)编码基因序列并进行生物信息学分析.根据自养菌的HAO基因序列保守区设计4对引物,通过RT-PCR获得预期大小的部分序列,再采用Genome walking PCR法向所得的部分序列两侧延伸;对所得序列在NCBI中进行blast分析,并用FGeneSB进行开放滨码框(Open read frame,ORF)预测.结果表明,RT-PCR获得了一段462 bp的序列,通过Genome walking PCR向两侧延伸后,获得了一段3 152 bp长的序列;ORF预测结果显示所得序列可能有4个ORF,RT-PCR获得的462 bp序列所在ORF长555 bp,对应氨基酸序列相对分子质量(M)大小为20.2×103;在Genebank中进行的Blast比对分析显示,除保守区的引物序列外,未发现有与此ORF存在明显相似性的HAO基因,表明这可能是一种新型羟胺氧化酶基因.图5表3参14     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

粘红酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ12-脂肪酸脱氢酶一般特异性催化在油酸的Δ12位引入双键转变成亚油酸.为了从粘红酵母YM25079中克隆全长Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列,参考已知的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增获得到全长为1 353 bp的c DNA序列,序列分析结果表明该序列具有一个编码450个氨基酸的完整开放阅读框,所编码蛋白质的大小为50.9×103.与报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ12-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证其功能,把开放阅读框序列亚克隆到表达载体p YES3/CT,构建重组表达载体p YRGD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达.脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性,能将油酸转化为亚油酸,亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%.以上结果表明,PCR所获得序列是新的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因.     

斜带石斑鱼alpha型与rho型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究II相去毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)等海水鱼类机体内代谢去毒过程中的作用及机制,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到斜带石斑鱼肝脏alpha-GST(GSTA)、rho-GST(GSTR)基因cDNA全序列.序列分析结果表明,斜带石斑鱼肝脏GSTA基因cDNA全长1008bp,编码223个氨基酸;GSTR基因cDNA全长1002bp,编码225个氨基酸.构建系统进化树发现,斜带石斑鱼与鲤鱼、斑马鱼GSTA氨基酸同源性较高,而GSTR为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有所有类型同源性均较低.     

十字花科蔬菜BcMF13同源基因的克隆及进化分析

在十字花科芸薹属的8个物种中扩增到与十字花科蔬菜花粉发育相关的一个重要基因BcMF13(GenBank登陆号:EF158459)的同源序列,获得8个同源序列的DNA序列全长602～607 bp,均含有一个内含子区,编码73个氨基酸,在内含子区内存在1个插入/缺失、5处颠换、4处转换.对8个同源基因的氨基酸比对发现该基因在十字花科物种内有很强的保守性.基于Kimura双参数距离,构建了BcMF13同源基因在十字花科中进化的NJ系统树,反映出南方大白菜与北方大白菜存在不同的演化过程.     

稀有鮈鲫Dmrt基因家族13个成员的克隆与序列分析

已经发现果蝇Doublesex、线虫Mab-3、青DMRT1Y/DMY和人类DMRT1等性别决定与分化基因均含有一个具有DNA结合能力的保守基序--DM结构域,对性别决定和性别分化具有调控功能.利用简并PCR,从稀有鲫基因组DNA中克隆了13个具有不同DM结构域的Dmrt基因家族成员.基于DM保守基序,建立了各物种的进化树.结果表明,稀有鲫基因组存在多个Dmrt基因成员,该基因在脊椎动物和非脊椎动物中具有高度保守性,是一种理想的环境内分泌干扰物研究的分子模型,在分子生态毒理学研究中具有很好的应用前景.     

真鲷去毒相关基因cDNA序列的克隆与肝脏组成型表达分析

赤潮发生时产生的一些海洋生物毒素对人类和海洋动物的安全形成潜在的威胁甚至导致死亡.为从分子水平探讨鱼类中海洋藻毒素的去毒分子机理,采用RT-PCR法克隆了真鲷(Pagrus major)肝脏芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)和I时相异生素代谢酶细胞色素P4501A(CYP1A)基因cDNA核心序列,同时,应用半定量RT-PCR方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在其指数期增长的范围内研究了芳香烃受体(AHR)、ARNT、CYP1A、II时相异生素代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA1、GSTA2)、rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70(HSP70)基因组成型表达水平.结果发现,真鲷ARNT、CYP1A基因cDNA核心序列片段分别长438bp和908bp,分别编码146和302个氨基酸.序列同源性分析发现,真鲷与门齿鲷(Stenotomus chrysops)、石首鱼(Micropogon undulatus)ARNT基因氨基酸序列同源性高达97.2%、95.2%,与斑马鱼(Brachydanio rerio)、人、大鼠、小鼠ARNT同源性较低(77.2%～79.3%).真鲷与门齿鲷、金头鲷(Sparus auratus)、欧洲川鲽(Rhombus maximus)、欧洲海鲈(Dicentrachus labrax)CYP1A基因氨基酸序列同源性较高,为84.8%～94.0%,与斑马鱼、人、小鼠CYP1A同源性较低,为59.6%～77.8%.真鲷肝脏AHR、ARNT、CYP1A、GSTA1、GSTA2、GSTR和HSP70基因组成型表达水平分别为(25.32±6.56)%、(26.22±4.24)%、(146.5±16.06)%、(55.42±3.75)%、(48.82±10.89)%、(79.47±3.13)%、(107.42±14.34)%.     

纳米银和银离子对斑马鱼胚胎早期生长发育的影响及作用机制

为探究纳米银对水生生物的毒性作用,选取斑马鱼胚胎为受试生物,考察了纳米银对斑马鱼胚胎早期生长发育的影响,同时比较了纳米银与银离子对斑马鱼胚胎的毒性作用和机理。实验将受精后4小时(4 hpf)的斑马鱼胚胎分别暴露于不同浓度的纳米银和银离子溶液中至96 hpf,观察并记录了胚胎的死亡、孵化和畸形等指标。应用吖啶橙(AO)染色实验研究了胚胎暴露之后的细胞凋亡情况,并且应用荧光定量PCR技术分析了相关基因的表达水平。研究结果表明,随着暴露浓度的增加,纳米银和银离子均能导致斑马鱼胚胎的死亡率增加和孵化率降低,并且引起孵化延迟。纳米银和银离子的96 h半数致死浓度(96 h-LC50)分别为11.75 mg·L-1和0.054 mg·L-1。银离子毒性远大于纳米银毒性。暴露的斑马鱼胚胎均表现出体长变短和卵黄囊肿大的畸形。AO染色结果表明,纳米银和银离子处理组胚胎的躯干和卵黄囊部位存在细胞凋亡信号。基因表达分析结果显示,1.93 mg·L-1纳米银显著提高了斑马鱼胚胎caspase9的表达(P0.05),而0.006 mg·L-1的银离子就能显著上调COX-2a(P0.01)和COX-17(P0.05)基因的表达,同时0.036 mg·L-1银离子增加了斑马鱼体内p53基因的表达(P0.05)。以上研究结果说明,纳米银可能通过caspase通路诱导细胞凋亡进而影响斑马鱼胚胎的生长发育;而银离子不但影响氧化系统基因通路,还能通过p53诱导凋亡进而阻滞斑马鱼胚胎的生长发育。     

热休克、Poly I:C上调草鱼GRP78基因表达

葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是细胞内一种应急蛋白,它通过对细胞内、外胁迫因子产生强烈的应答而调节内质网稳态.草鱼(Ctenopharyngodon idellus)GRP78克隆于草鱼肝肾cDNA文库,全长2 490 bp.其中,5'非编码区为155 bp,含有7个热休克元件,3'非编码区为373 bp,最大开放阅读框为1 962 bp,编码653个氨基酸.序列分析表明,草鱼GRP78的N端包含3个HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,草鱼GRP78与人及其它动物的同源性很高.适应性进化分析也显示GRP78非常保守,受到强烈的功能约束,说明该蛋白质在进化中非常重要.RT-PCR分析表明,相对于本底水平,34℃热激和Poly I:c诱导后,草鱼GRP78在肝、肾等组织巾的表达明显上调.图4表1参16     

绿僵菌钙传感蛋白基因克隆及其与致病性的关系

通过筛选文库获得绿僵菌钙传感蛋白基因MaNcs1基因全长cDNA序列,并对其在致病过程中的作用进行了分析.结果显示,MaNcs1基因cDNA全长792 bp,开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸;采用RNA干扰技术下调该基因的表达后,对东亚飞蝗的生测实验表明,绿僵菌毒力显著下降,说明该基因与绿僵菌的致病性有关,为以后深入研究该基因的致病机制奠定了基础.     

稀有鮈鲫成体神经发生相关基因的分子克隆及序列分析

成体神经发生是脊椎动物中广泛存在的一种生物学特征。成体硬骨鱼类的脑展现出强烈的神经活性以及出色的脑修复能力,这使得硬骨鱼类成为研究成体神经发生和脑修复的一个理想的模型。本文克隆了成体稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)脑组织中神经发生及脑修复相关的hes5、pax6、sox11和prox1基因的部分c DNA序列并进行了序列分析。序列分析结果表明,pax6和sox11基因片段与斑马鱼(Danio rerio)对应的基因片段的同源性最高,分别为97%和94%;hes5基因与鲤鱼(Cyprinus carpio)相对应的基因片段的同源性最高,为92%;prox1基因在物种间的同源性最低。基于稀有鮈鲫和已知物种相应基因的核苷酸序列构建了系统发育树,发现稀有鮈鲫prox1基因与其他硬骨鱼类的亲缘关系最远。本文为进一步开展神经毒性类化学品对水生生物鱼类的成体神经毒性作用机制研究提供了分子生物学基础。