五氯酚暴露诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡相关基因的变化及caspase-2基因克隆和系统进化分析

应用基因芯片技术研究发现,暴露于五氯酚的斑马鱼胚胎中有14个涉及细胞凋亡行为的基因表达发生了显著改变.利用生物信息学方法构建这些功能基因系统进化树,分析与环境毒物诱导的细胞凋亡行为密切相关的caspase-2基因和其他基因之间的同源关系.斑马鱼caspase-2基因由10个外显子和9个内含子组成,cDNA长1308bp,含一个开放阅读框(ORF),编码435个氨基酸.6种脊椎动物Caspase-2氨基酸序列的保守性及系统进化分析结果表明,在特定功能区结构域中氨基酸序列表现出较高的同源性,Caspase-2在进化上高度保守.利用RT-PCR技术,斑马鱼caspase-2基因cDNA被克隆并确认.研究结果表明斑马鱼caspase-2基因是一个研究细胞凋亡行为的模型分子,可为环境化合物的分子毒性评价及其机制研究提供一种分子标记。     

麻疯树叶绿ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱胞和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列.对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1 368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量(Mr)大小为52.1×103.同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性.RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达.此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能.对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累.上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶.     

苋菜蓝光受体基因AmCRY1密码子使用模式及分析

为了解苋菜AmCRY1基因密码子的使用偏好性、与其他物种CRY1基因的同源关系及异源表达受体,利用CodonW与EMBOSS程序及Excel 2017、SPSS 24、Origin 2018等软件,分析苋菜与其他物种中的CRY1基因的密码子使用特性,比较苋菜AmCRY1基因与模式生物的密码子使用频率.结果表明:苋菜AmCRY1基因的密码子的有效密码子数(ENc)值为54.42,GC含量和GC3含量均低于50%,这表明苋菜AmCRY1偏好使用以A/T结尾的密码子,且在其编码区序列中A+T含量大于G+C;苋菜AmCRY1基因中,偏好性较强的密码子有29个(RSCU 1),偏好性最强的有1个(RSCU 2),其中以A/T结尾的密码子有22个,这表明苋菜AmCRY1基因的密码子偏好以A/T结尾,一些氨基酸对密码子的使用具有较强的偏好性;苋菜AmCRY1基因的密码子在ENc绘图中的基因位点更接近期望曲线,说明在进化过程中苋菜AmCRY1基因的密码子偏好性受突变压力的影响较大;苋菜AmCRY1基因的密码子使用偏好性参数与石竹目物种相近,同源关系较近物种密码子使用偏好性具有相似性;从密码子使用频率上分析得出,酵母菌表达系统更适合苋菜AmCRY1的异源表达,模式植物拟南芥、烟草、番茄均可作为苋菜AmCRY1基因的遗传转化受体,同苋菜代谢途径相似的甜菜也可以作为苋菜AmCRY1基因的瞬时表达受体.本研究表明苋菜AmCRY1密码子偏好以A/T结尾且受突变压力影响,结果可为进一步的功能研究尤其是异源表达验证提供参考.(图5表3参35)     

西番莲查尔酮合成酶(CHS)基因家族全基因组鉴定及表达模式北大核心CSCD

为了解西番莲(Passiflora edulis Sims f.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因家族的分子进化特性及其在果皮着色与非生物胁迫中的功能,从Pfam数据库下载CHS蛋白HMM模型,并使用HUMMER 3.0、Blast工具和CDD-search鉴定出西番莲基因组中的CHS基因.采用TBtools、EXPASy、MEGA 7.0、MEME、PRAB、SWISSMODEL和PlantCARE等软件对其氨基酸与碱基序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR的方法检测西番莲CHS(PeCHS)基因家族成员进行表达模式分析.研究结果显示西番莲基因组中共有11个PeCHS基因家族成员,分布在6条染色体上,可分为4个亚族,基因结构分析显示2个PeCHS(PeCHS5和PeCHS9)基因具有3个外显子,其他PeCHS基因只具有2个外显子.西番莲物种内共线性分析结果显示两个PeCHS基因对具有片段重复特征:PeCHS3-PeCHS6和PeCHS7-PeCHS9.多物种共线性分析结果显示,只有PeCHS10基因与其他物种具有进化关系.启动子顺式作用元件分析表明该基因家族成员启动子上含有大量逆境胁迫和激素、响应元件.qRT-PCR结果显示PeCHS基因在紫色果皮中的表达量明显高于黄色果皮,且大部分PeCHS基因的表达量在紫色西番莲果皮转色后显著增加.此外,分别有5个(PeCHS3、PeCHS4、PeCHS6、PeCHS8、PeCHS10)和6个(PeCHS1、PeCHS3、PeCHS4、PeCHS7、PeCHS8、Pe CHS11)基因的表达量在高温与低温胁迫下显著提高.本研究表明西番莲的CHS家族成员序列相对保守,并且部分成员可能在果皮花青素积累与温度胁迫中发挥重要作用.(图10表4参53)     

人类转录因子样新基因TFL76的初步研究

运用基于基因组数据库特定基因同源基因的克隆策略得到人类新基因TFL76 ,它编码 12个C2 H2 型锌指基序 .其cDNA序列长 2 2 6 8bp,预测的编码蛋白含 6 77个氨基酸 ,分子量 (Mr)为 76× 10 3 .生物信息学分析表明 ,TFL76的N末端含有多种蛋白激酶的磷酸化位点和核定位信号 ,具有转录因子的特征 .染色体定位为 19q13.4 ,此位点存在很多与癌症相关的基因 .对 9.5d和 10 .5d的鼠胚进行全胚原位杂交 ,结果表明 ,此基因在前肢芽和后肢芽表达较高 .图 5表 1参 5     

抗禾谷孢囊线虫基因中核苷酸结合位点区(NBS)-亮氨酸重复序列区(LRR)的克隆与序列分析

根据源于节节麦抗禾谷孢囊线虫基因Cre3及已经克隆的NBS-LRR类植物抗病基因的NBS与LRR区保守序列分别设计特异引物,从易变山羊草基因组中PCR扩增得到两个扩增条带,它们的大小分别约为530bp和1200bp.经克隆测序发现,这两个序列分别长为532bp和1175bp,且是连续的.它们有32bp的共同序列,总长为1675bp,包含了一个NBS-LRR区和一个不完整的开放阅读框,没有起始密码子、终止密码子和内含子结构.它编码一个557个氨基酸的蛋白质,分子量(Mr)为63.537×103,含有NBS区保守模体ILDD,ESKILVTTRSK,KGSPLAARTVGG,RRC-FAYCS,EGF,以及LRR区的保守模体aXXLXXLXXL.它与Cre3的核苷酸和氨基酸同源性分别为87.8%和77%,可能是一个抗禾谷孢囊线虫基因.图6参13     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

福州宦溪野生蕉CBF7的cDNA与启动子克隆及在不同温度下的表达特性

CBF(CRT/DRE-binding factor)在植物低温响应及抗寒性的形成中起着重要的作用.香蕉基因组中只包含有1个CBF7基因,以香蕉基因组序列为参考,采用同源克隆的方法,从福建宦溪野生蕉(Musa itinerans)叶片中克隆CBF7-1基因的c DNA全长序列及其启动子序列.生物信息学分析显示宦溪野生蕉的CBF7-1具有植物CBF家族的典型AP2结构域,物种间序列特异性强;启动子富含多种类型的顺式作用元件,并且具有Cp G岛.q PCR分析表明CBF7-1在28℃时表达量最高,随着温度降低表达量逐渐下降,但在0℃时反而又升高.这表明宦溪野生蕉的CBF7-1可能与低温胁迫、耐热性均相关.     

麻疯树叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱饱和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列．对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量（Mr）大小为52．1×10^3．同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他植物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性．RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达．此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能．对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累．上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶．图4表2参21     

苋菜AmMYB2基因密码子偏好性与进化分析

为了解苋菜AmMYB2基因的密码子使用偏好性、与不同物种中调控色素相关的R2R3-MYB基因的同源关系及异源表达受体,利用Codon W与EMBOSS程序及Excel、SPSS、Origin等软件,分析苋菜与其他物种中调控色素代谢的R2R3-MYB基因的密码子使用偏好性,比较苋菜AmMYB2基因与模式生物的密码子使用频率.结果显示:苋菜AmMYB2基因中,所有密码子的GC、GC1、GC2、GC3含量均低于50%,偏好性较强的密码子有17个(RSCU 1),偏好性最强的有7个(RSCU 2),其中以A/T结尾的密码子有19个,表明苋菜AmMYB2基因的密码子偏好以A/T结尾,一些氨基酸对密码子的使用具有较强的偏好性;苋菜AmMYB2基因密码子的有效密码子数(Effective number of codons,ENC)值为49.63,苋菜AmMYB2基因的密码子在ENC绘图中的基因位点更接近期望曲线,说明在进化过程中苋菜AmMYB2基因的密码子偏好性受突变压力的影响较大;苋菜基因与甜菜色素代谢相关的R2R3-MYB基因的密码子使用偏好性参数相近,同源关系较近物种密码子使用偏好性具有相似性;从密码子使用频率上分析得出,酵母菌表达系统更适合苋菜AmMYB2基因的异源表达,模式植物拟南芥、烟草、番茄均可作为苋菜AmMYB2基因的遗传转化受体,同苋菜代谢途径相似的甜菜也可以作为苋菜AmMYB2基因的瞬时表达受体.本研究可为苋菜AmMYB2基因功能的进一步研究提供重要参考.(图5表2参31)     

南海球形棕囊藻质体16SrDNA序列分析

测定了采自香港2株球形棕囊藻和湛江1株等鞭金藻质体16SrDNA基因序列,结合GenBank中下载的32条同源序列,分析序列特征并构建分子系统树。发现600bp序列中有可变位点42个,简约信息位点33个,可变位点和简约信息位点分别为全序列的7．0％和5．5％。A＋T的含量（52．5％）略大于C＋G含量（47．5％）,与已报道的棕囊藻属叶绿体和线粒体基因相似;在分子系统树上,同属藻种聚类在一起,属间遗传距离分别为0．0255-0．0503。棕囊藻属属内遗传距离0-0．0050,不同藻种相混杂,并未独立成支;质体16srDNA部分序列虽不能区分棕囊藻属内不同藻种,但能鉴定出GenBank中27个环境样品为棕囊藻属藻株,从而能确定其地理分布和相对丰度,对棕囊藻赤潮的预测预报具有重要意义。质体16srDNA在其他赤潮藻类物种鉴定方面的应用需要进一步研究。     

热休克、Poly I:C上调草鱼GRP78基因表达

葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是细胞内一种应急蛋白,它通过对细胞内、外胁迫因子产生强烈的应答而调节内质网稳态.草鱼(Ctenopharyngodon idellus)GRP78克隆于草鱼肝肾cDNA文库,全长2 490 bp.其中,5'非编码区为155 bp,含有7个热休克元件,3'非编码区为373 bp,最大开放阅读框为1 962 bp,编码653个氨基酸.序列分析表明,草鱼GRP78的N端包含3个HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,草鱼GRP78与人及其它动物的同源性很高.适应性进化分析也显示GRP78非常保守,受到强烈的功能约束,说明该蛋白质在进化中非常重要.RT-PCR分析表明,相对于本底水平,34℃热激和Poly I:c诱导后,草鱼GRP78在肝、肾等组织巾的表达明显上调.图4表1参16     

近江牡蛎4种类型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究不同类型谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因在近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)等贝类体内代谢去毒过程中的作用,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到近江牡蛎肝脏4种类型GST基因cDNA全序列.序列分析结果表明,mu、pi、omega、sigma4种类型GST基因cDNA全长分别为970bp、773bp、999bp、1277bp,分别编码215、207、242、203个氨基酸.构建系统进化树发现,除太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)pi型GST外,所有类型GSTs序列都能各自聚集成一簇.     

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2 000 bp,大多数片段在400 bp和800 bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18 bD和右边界外234 bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.图2表2参24     

葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)YF6脂肪酶基因的克隆及其序列分析

筛选并鉴定了1株高产脂肪酶菌株葡枝根霉YF6,并采用简并PCR等分子技术从中克隆到1个新的脂肪酶基因lipRs及其对应的全长cDNA,序列分析表明,该基因编码区全长1173bp,不含内含子序列,编码1段由26个氨基酸残基组成的信号肽和1个由365个氨基酸残基组成的成熟蛋白,该成熟蛋白计算分子量(Mr)为39268.27,等电点为pH7.66,有5个可能的N-糖基化位点,含有脂肪酶特征序列GHSLGGA,与来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶(AAF32408)同源性最高,一致性为83%,相似性为89%.该基因序列已提交GenBank,登录号为DQ139862.     

Molecular phylogeny of vestimentiferans collected around Japan, revealed by the nucleotide sequences of mitochondrial DNA

The phylogenetic relationships among local populations of undescribed vestimentiferan species that belong to the genera Lamellibrachia and Escarpia and had been collected at six sites around Japan were analyzed on the basis of the partial (1023 bp) nucleotide sequences of the mitochondrial gene for cytochrome oxidase I (COI), using a pogonophoran and a polychaete as outgroups. The identical amino acid sequence was deduced from the nucleotide sequence obtained from each of the vestimentiferans analyzed. The strong similarity among deduced amino acid sequences of COI suggested a close relationship between vestimentiferans and pogonophorans. On the basis of the phylogenetic relationships, the analyzed vestimentiferan populations were classified tentatively as five species. The genetic differentiation of vestimentiferans was suggested to occur bathymetrically as well as being a consequence of horizontal segregation. Two of these tentatively identified species inhabit both a hydrothermal area and a cold seep area, as is the case for some species of bivalves that belong to the genera Bathymodiolus and Calyptogena. Received: 28 August 1996 / Accepted: 2 October 1996     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因β-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列.结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸.实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列.所获基因与其它动物类群的β-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物β-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守.系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

斜带石斑鱼alpha型与rho型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究II相去毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)等海水鱼类机体内代谢去毒过程中的作用及机制,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到斜带石斑鱼肝脏alpha-GST(GSTA)、rho-GST(GSTR)基因cDNA全序列.序列分析结果表明,斜带石斑鱼肝脏GSTA基因cDNA全长1008bp,编码223个氨基酸;GSTR基因cDNA全长1002bp,编码225个氨基酸.构建系统进化树发现,斜带石斑鱼与鲤鱼、斑马鱼GSTA氨基酸同源性较高,而GSTR为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有所有类型同源性均较低.