产蛋白酶北极海洋耐冷菌ArcB82306的筛选及其蛋白酶性质

从北极加拿大海盆海水中分离到一株产蛋白酶耐冷菌株ArcB82306.16S rDNA基因序列的同源性分析表明,该菌株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).蛋白酶酶谱显示该菌株分泌多种胞外蛋白酶.胞外蛋白酶的最适作用温度和最适pH分别为45℃和9.菌株ArcB82306所产蛋白酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制,金属蛋白酶抑制剂EDTA以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对蛋白酶活性无影响,结果提示该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶.金属离子Ni2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+可部分抑制酶的活性,而DTT和巯基乙醇等还原剂及Triton X-100和吐温-80等表面活性剂对酶活性无显著影响.     

枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用

从小麦根际土壤中分离到一株对多种植物病原真菌有拮抗作用且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis T2.经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,获得具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株.与出发菌株相比,培养48 h的正突变株胞外蛋白酶活力提高108.5%,负突变株蛋白酶活力降低81.1%,而二者的几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均无显著变化.正突变株对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum)的平板拮抗作用增强,其粗酶液可使该菌菌丝变形膨大成珠状、原生质浓缩,萌发的孢子芽管短且畸形膨大;负突变株对该菌的平板拮抗作用显著降低,粗酶液对该菌菌丝和孢子的形态无明显作用.表明提高生防芽孢杆菌胞外蛋白酶的活力可增强其拮抗病原真菌的能力.     

绿僵菌降解寄主表皮的蛋白酶同工酶研究

研究了不同碳氮源对金龟子绿僵菌（ Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ） 产生与分解昆虫外壳相关的蛋白酶活性和同工酶谱带的影响． 结果表明：蝉蜕、虻虫壳、蝇蛆壳、蚕蛹壳、虾壳、胶体几丁质均可使金龟子绿僵菌产生蛋白酶,虾壳和胶体几丁质所产生的蛋白酶比活性最高,蝉蜕次之． 但蛋白酶总活性以蝉蜕最高,虻虫壳次之．样品经等电聚焦电泳后,印迹于Ｘ光片上,显示蛋白酶同工酶,蝉蜕和蚕蛹壳产生的蛋白酶同工酶谱带最丰富． 以蝉蜕为唯一碳氮源时,金龟子绿僵菌产生蛋白酶的最佳条件为２６℃、初始ｐＨ６．０ 、最终孢子浓度ｎ＝ １×１０７ｍＬ－１ ．     

Bt抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的变化

采用酶特异性底物测定了3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫品系幼虫中肠蛋白酶活性的最适pH值.结果表明,3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫中肠总蛋白酶活性最适pH值均为10.5;强碱性类胰蛋白酶活性最适pH值除3龄Bt抗性幼虫为8.0外,其余均为10.5;弱碱性类胰蛋白酶活性的最适pH值为8.0;类胰凝乳蛋白酶的最适pH值除5龄Bt抗性幼虫的为8.0外,其余都为8.5.比较了最适pH值条件下,3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫中肠蛋白酶活性的差异.发现3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫中肠总蛋白酶活力差异不显著;两个品系3龄幼虫中肠强碱性类胰蛋白酶活性差异达到极显著水平,5龄幼虫中肠强碱性类胰蛋白酶活性差异不明显;两个品系3龄幼虫中肠弱碱性类胰蛋白酶活力差异没有达到显著水平,而5龄幼虫弱碱性类胰蛋白酶活力差异极显著;另外,3龄和5龄Bt抗性/敏感棉铃虫幼虫类胰凝乳蛋白酶活力差异极显著.棉铃虫幼虫中肠酸碱强度和某些蛋白酶活性的变化,可能是造成棉铃虫抗性演化的因素之一.图2表1参17     

蜡蚧轮枝菌入侵蚧虫表皮过程中蛋白酶和几丁质酶的作用

研究了蜡蚧轮枝菌两个菌株No.V3.4504和No.V3.4505感染沙里院褐球蚧的外观症状、入侵体壁的过程及胞外蛋白酶与几丁质酶的作用.结果发现.用菌株No.V3.4504的孢子悬浮液感染蚧虫2 d后,在虫体表面蜡粉稀薄的位置和柔软的虫体腹面出现了菌丝,5 d后菌丝覆盖虫体,7 d后菌丝层加厚,虫体开始死亡.显微切片观察.在体壁的外表皮、内表皮和真皮层都发现了菌丝.说明该菌已侵染成功.以蚧虫的表皮为培养基对这两个菌株连续培养8 d,发现菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在前6天连续上升,最大值为(33.94±1.61)U/g,然后降低;几丁质酶活性在前期维持在一个较低水平,d 5开始增加,最大值为(7.28±1.36)U/g.菌株No.V3.4505的蛋白酶和几丁质酶的活性变化趋势与No.V3.4504相似.说明蛋白酶在菌丝侵染体壁的前期发挥了作用,降解表皮中的蛋白质,使几丁质暴露,诱导几丁质酶的大量产生,从而分解几丁质.图3表2参22     

白僵菌分生孢子深层培养及其对马尾松毛虫的毒力

对 3株球孢白僵菌的液体深层培养研究表明,碳源、氮源对白僵菌液生分生孢子的形成具有显著影响.葡萄糖、蔗糖、乳糖是液体培养分生孢子的较好碳源,而黄豆粉、花生粉、(NH4 )2SO4则是较理想的氮源.吐温 80对白僵菌液生分生孢子的形成具有显著的影响,培养基中吐温 80含量在 0. 4% ~0. 8%之间时,有利于液生分生孢子的形成,产孢量(n)达 7. 30×1010 ~24. 13×1010 L-1.对 2~3龄马尾松毛虫幼虫的室内毒力测定表明,液生分生孢子和气生分生孢子对马尾松毛虫的毒力相近.图 1表 6参 16     

UASB和EGSB反应器中厌氧颗粒污泥生物学特性的比较

测定了实验室规模的２Ｌ ＥＧＳＢ和ＵＡＳＢ反应器中培养的厌氧颗粒污泥在不同基质中的比产甲烷活性、辅酶Ｆ４２０含量和胞外多聚酶物含量,结果表明,ＥＧＳＢ反应器颗粒污泥在葡萄糖上的比产甲烷活性、利用乙酸的甲烷菌和产氢产乙酸菌的活怀和胞外多聚物／含量高于ＵＡＳＢ反应器颗粒污泥,而ＵＡＳＢ反应器颗粒污泥中利用甲酸和氢的甲烷菌的活性以及辅酶Ｆ４２０的含量较ＥＧＳＢ反应器颗粒污泥更高,辅酶Ｆ４２０可以指示同种     

响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析

短小芽孢杆菌SCU11是由本实验室分离的野生菌株BA06经过复合诱变得到的高产碱性蛋白酶菌株,其产生的碱性蛋白酶在生物制革领域具有很好的应用前景.为进一步提高菌株的蛋白酶产量以满足工业生产的需求,本研究利用响应面法优化菌株产蛋白酶的发酵培养条件.在前期单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、中心组合实验设计和响应面分析法,确定了当黄豆粉浓度为53.3 g/L,温度为28℃时,蛋白酶活有理论最大值8 884 U/m L,摇瓶实验验证酶活为8 768 U/m L,达到理论预测值的98.7%,比优化前酶活提高了1倍.为了解优化的发酵条件使蛋白酶产量提高的原因,对短小芽孢杆菌蛋白酶基因及相关调控基因的表达情况进行荧光定量PCR分析,结果显示,优化后5种蛋白酶基因的表达量上调,1种表达量下调;5种蛋白酶相关调控基因的表达量增加,2种基因表达量降低.推测是优化后正调控基因表达量的增加以及负调控基因表达量的降低,促进了短小芽孢杆菌胞外蛋白酶基因转录水平的提高,导致胞外蛋白酶产量增加.本研究采用响应面法优化发酵条件使短小芽孢杆菌SCU11蛋白酶产量提高了1倍,并为阐明其表达调控机制奠定了基础.(图3表7参24)     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

UV-B辐射增强对苹果炭疽菌生长特性及其过氧化氢酶活性的影响

在UV-B辐射增强条件下,在UV-B不同剂量率和不同剂量作用下,研究了苹果炭疽菌(Colletrotrichum gloeosporioildes)菌丝的生长速率、产孢性状、分生孢子的萌发特性和过氧化氢酶活性.实验得出,菌落直径、菌丝体干质量、产孢量、分生孢子的萌发及过氧化氢酶(CAT)活性受UV-B的促进,促进作用与剂量率即单位时间内的辐射剂量呈正相关,同一剂量率的不同剂量对苹果炭疽菌的影响没有显著差异.结果表明,UV-B辐射增加,促进了苹果炭疽的生物积累,抗逆性增强,诱导了抗氧化防御系统过氧化氢酶活性,UV-B对苹果炭疽菌的作用不呈累积效应.     

原生质体融合构建高产碱性蛋白酶工程菌

用原生质体融合的方法，将碱性蛋白酶生产菌2709与含有碱性蛋白酶基因克隆载体pDW2的工程菌枯草杆菌BD105进行细胞融合，得到1株高产碱性蛋白酶的工程菌A16，菌落的原位杂交表明，该菌株携有双亲的遗传物质，A16的表型与生长特征与2709相似，但同样条件下发酵酶活比2709高50%-100%，摇瓶发酵的产酶水平最高可达30000u/mL,A16发酵所产酶的最适pH与耐温性及发酵条件等特征均与2709相同。适用于工业生产。     

黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

黑曲霉Aspergillsu niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为:中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质

对鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化方法及其性质进行了研究 .其中 ,蛋白酶的纯化步骤包括 :(1)硫酸铵沉淀 ;(2 )SephadexG 10 0凝胶过滤 ;(3)DEAE Sepharose色谱分离 ;(4)DEAE Cellulose (DE 32 )色谱分离 .经上述纯化步骤得到两种蛋白酶 ,经SDS PAGE分析 ,Mr分别为 37.4× 10 3 和 33.1× 10 3 .以偶氮酪蛋白 (azocasein)作底物测其水解酶活性 ,结果表明二者差别显著 ,前者明显高于后者 .而且 ,Mr37.4× 10 3 的蛋白酶在pH 7～ 10范围内均显示较高活性 ,在 4 0～ 6 0℃范围内稳定性好 .结果表明该蛋白酶是一种金属蛋白酶 .关于该蛋白酶对牙鲆(Paralichtysolivaceus)的毒性作用尚在研究之中 .图 6表 3参 17     

大豆胰蛋白酶抑制剂对斜纹夜蛾生长发育的影响

以广食性害虫斜纹夜蛾（Prodenia litura Fabriciu）为研究对象,连续6代自二龄或三龄开始用含有大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor,SBTI）的人工饲料饲养幼虫,饲养至乳化时分别测定SBTI对斜纹夜蛾幼虫体质量、发育历期和蛹质量的影响。结果表明,SBTI显著抑制幼虫体质量的增长,使幼虫发育延缓,连续饲养6代,与对照相比,对2龄、3龄SBTI处理的幼虫体质量的抑制率分别从60%降至21%、49%降至17%;SBTI显著抑制斜纹夜蛾的蛹质量,使蛹质量减轻,连续饲养6代,与对照相比,对2龄、3龄SBTI处理的幼虫其蛹质量的抑制率分别从37%降至4%、16%降至2%;SBTI延迟幼虫的生长发育,使得世代历期延长;而且SBTI对低龄幼虫的抑制作用更加显著。随着继代代数的增加,SBTI对幼虫体质量的抑制作用减小,体质量增长加快,幼虫发育期缩短;SBTI对蛹质量的抑制作用减弱,蛹质量增加,斜纹夜蛾世代历期缩短。研究结果说明斜纹夜蛾可以通过调节自身的生长发育过程,提高幼虫适应SBTI的能力,逐步缓解SBTI的抑制作用。     

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.图5表2参18     

皮革废物铬革屑的微生物学处理研究Ⅱ:降解革屑微生物的发酵条件及其蛋白酶的降解研究

在以皮胶原为碳、氮源时其最适产酶条件为ｐ Ｈ７ ,３０ ℃,高产酶时间为４ ｄ ．经 Ｃａ（ Ｏ Ｈ）２ 预处理革屑不能有效促进该菌对革屑的降解,但可使大部分 Ｃｒ３ ＋ 沉淀而除去．经该株蛋白酶的粗提及性质实验,确定酶的最适反应条件为４０ Ｃ、ｐ Ｈ７ ．０ ～８ ．０ , Ｃｒ３ ＋ 对酶有轻度的抑制作用,以２ ．２６ ％ 的粗酶作用于革屑,水解率达５０ ％ 以上     

4种玉米水解肽的除草活性及与相对分子质量的关系

以碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶4种蛋白酶为水解酶制备玉米蛋白水解肽,用培养皿生物分析法检测在不同浓度(0.5、1.0、2.0和5.0 mg.mL-1)下的4种玉米蛋白水解肽对光鳞水蜈蚣(Kyllingabrevitoliavar.leiolepis)种子萌发过程中根系生长的抑制活性;采用超滤法制备相对分子质量不同的肽段并比较其除草活性。结果表明:不同浓度下的4种玉米蛋白水解肽对光鳞水蜈蚣种子萌发过程中根系生长均有抑制作用,且随着水解肽浓度的增高,其对根系生长的抑制活性增强;碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶制备的玉米蛋白粉水解肽对根系生长的抑制活性明显高于风味蛋白酶和中性蛋白酶制备的玉米蛋白粉水解肽。相对分子质量不同的玉米蛋白粉水解肽对根系生长的抑制活性存在差异,5 000 u以下的小分子肽具有更高的抑制活性。