鳜鱼两种谷胱甘肽S-转移酶基因cDNA的克隆与分析

鳜鱼(Siniperca chuatsi)是我国著名的肉食性鱼类,容易成为环境毒素的富集体.论文从分子水平上分析了鳜鱼去毒过程中起关键作用的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的结构及进化上的地位,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到了鳜鱼肝脏可溶性alpha型(GSTA)和rho型(GSTR)基因cDNA全序列.结果表明,鳜鱼肝脏GSTA、GSTR全长分别为1052bp、935bp,其中5′-UTR分别为118bp、55bp,3′-UTR分别为262bp、202bp,分别编码223、225个氨基酸.系统分析结果显示:鳜鱼GSTA与GSTR在进化树上的位置与其分类所处的位置基本吻合.     

真鲷去毒相关基因cDNA序列的克隆与肝脏组成型表达分析

赤潮发生时产生的一些海洋生物毒素对人类和海洋动物的安全形成潜在的威胁甚至导致死亡.为从分子水平探讨鱼类中海洋藻毒素的去毒分子机理,采用RT-PCR法克隆了真鲷(Pagrus major)肝脏芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)和I时相异生素代谢酶细胞色素P4501A(CYP1A)基因cDNA核心序列,同时,应用半定量RT-PCR方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在其指数期增长的范围内研究了芳香烃受体(AHR)、ARNT、CYP1A、II时相异生素代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA1、GSTA2)、rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70(HSP70)基因组成型表达水平.结果发现,真鲷ARNT、CYP1A基因cDNA核心序列片段分别长438bp和908bp,分别编码146和302个氨基酸.序列同源性分析发现,真鲷与门齿鲷(Stenotomus chrysops)、石首鱼(Micropogon undulatus)ARNT基因氨基酸序列同源性高达97.2%、95.2%,与斑马鱼(Brachydanio rerio)、人、大鼠、小鼠ARNT同源性较低(77.2%～79.3%).真鲷与门齿鲷、金头鲷(Sparus auratus)、欧洲川鲽(Rhombus maximus)、欧洲海鲈(Dicentrachus labrax)CYP1A基因氨基酸序列同源性较高,为84.8%～94.0%,与斑马鱼、人、小鼠CYP1A同源性较低,为59.6%～77.8%.真鲷肝脏AHR、ARNT、CYP1A、GSTA1、GSTA2、GSTR和HSP70基因组成型表达水平分别为(25.32±6.56)%、(26.22±4.24)%、(146.5±16.06)%、(55.42±3.75)%、(48.82±10.89)%、(79.47±3.13)%、(107.42±14.34)%.     

近江牡蛎4种类型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究不同类型谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因在近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)等贝类体内代谢去毒过程中的作用,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到近江牡蛎肝脏4种类型GST基因cDNA全序列.序列分析结果表明,mu、pi、omega、sigma4种类型GST基因cDNA全长分别为970bp、773bp、999bp、1277bp,分别编码215、207、242、203个氨基酸.构建系统进化树发现,除太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)pi型GST外,所有类型GSTs序列都能各自聚集成一簇.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因b-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列. 结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸. 实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列. 所获基因与其它动物类群的b-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物b-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守. 系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

近江牡蛎等7种养殖鱼虾贝类参照基因β-肌动蛋白cDNA序列的克隆与比较分析

为进一步研究水产养殖动物功能基因的表达调控,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肝脏β-肌动蛋白基因cDNA全序列.结果表明,近江牡蛎β-肌动蛋白基因cDNA全长1343bp,其中5′、3′非翻译区(UTR)分别长68bp、144bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸.实验同时成功获得了中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、斑鳢(Channa maculata)、胡子鲶(Clarias fuscus)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲮鱼(Cirrhinus molitorella)6种重要淡水养殖动物肝脏β-肌动蛋白基因cDNA的核心序列及氨基酸序列.所获基因与其它动物类群的β-肌动蛋白基因氨基酸同源性高达96%以上,表明软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等不同类群动物β-肌动蛋白基因在生物进化过程中高度保守.系统发育分析显示软体类、节肢类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类脊椎动物β-肌动蛋白分类与传统的分类基本一致.     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及组织特异性表达分析

采用SSH (Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR (Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到来自甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体'NDF-1'的一个差异表达基因编码区的全长cDNA序列,命名为Bncp5.该基因全长1 224 bp,含有1 080 bp的完整开放阅读框,编码359个氨基酸.该基因编码区与甘蓝中一个与衰老相关的半胱氨酸蛋白酶基因(登录号AF454960)同源性达97%,氨基酸序列同源性达到100%. Bncp5编码的蛋白相对分子质量为39.5×103,等电点为5.57.对其活性位点的分析表明其具备真核生物半胱氨酸蛋白酶的活性中心,且有很高的功能区段保守性,推测为一跨膜蛋白.相对定量PCR的检测结果表明, Bncp5在野生型和矮化突变体的根、茎、子叶和真叶中都有表达,但是表达量存在显著性差异.在野生型高秆油菜中,根的表达量最低,在真叶的表达量最高;在矮化突变体中,根、茎中的表达明显高于野生型,而在子叶和真叶中的表达量与野生型油菜的表达量基本一致.     

葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)YF6脂肪酶基因的克隆及其序列分析

筛选并鉴定了1株高产脂肪酶菌株葡枝根霉YF6,并采用简并PCR等分子技术从中克隆到1个新的脂肪酶基因lipRs及其对应的全长cDNA,序列分析表明,该基因编码区全长1173bp,不含内含子序列,编码1段由26个氨基酸残基组成的信号肽和1个由365个氨基酸残基组成的成熟蛋白,该成熟蛋白计算分子量(Mr)为39268.27,等电点为pH7.66,有5个可能的N-糖基化位点,含有脂肪酶特征序列GHSLGGA,与来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶(AAF32408)同源性最高,一致性为83%,相似性为89%.该基因序列已提交GenBank,登录号为DQ139862.     

绿僵菌钙传感蛋白基因克隆及其与致病性的关系

通过筛选文库获得绿僵菌钙传感蛋白基因MaNcs1基因全长cDNA序列,并对其在致病过程中的作用进行了分析.结果显示,MaNcs1基因cDNA全长792 bp,开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸;采用RNA干扰技术下调该基因的表达后,对东亚飞蝗的生测实验表明,绿僵菌毒力显著下降,说明该基因与绿僵菌的致病性有关,为以后深入研究该基因的致病机制奠定了基础.     

环境基因组DNA脂肪酶基因克隆与分析

为了建立从环境基因组DNA中直接克隆脂肪酶基因的通用方法,抽提餐馆灶台油污的环境基因组DNA,采用简并PCR等分子技术从中克隆到脂肪酶基因lip42及其对应的全长cDNA.序列分析表明该基因的cDNA编码区序列全长为1692bp,编码1段由19个氨基酸残基组成的信号肽和1段由544个氨基酸残基组成的成熟肽,计算相对分子质量为61541.51,其中含有强碱性氨基酸残基42个,强酸性氨基酸残基56个,等电点pI为5.428,有2个可能的N-糖基化位点.BLAST比对分析表明该序列与已发表的白地霉(Geotrichum geotrichum)脂肪酶基因(U02541)在核苷酸水平的一致性为99%.该基因序列提交GenBank,登录号为DQ313172.将该脂肪酶基因的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经罗丹明B平板功能筛选得到具脂肪酶活性的重组毕赤酵母菌株[GS115(pAMB768)],验证了直接从环境基因组DNA克隆脂肪酶基因的有效性.图3表1参27     

淇河鲫生长激素全长cDNA的克隆与序列分析

采用RT-PCR法和3',5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends)法从淇河鲫脑垂体RNA克隆出生长激素(Growthhormone,GH)cDNA.此cDNA全长1 191 nt[含Poly(A)14 nt],其5'端非编码区长55 nt,阅读框(Open reading frame,OAF)长633 nt,3'端非编码区长503 nt.由其推导的GH前体由210个氨基酸组成,其中氮端前22个氨基酸为信号肽部分.氨基酸序列比较表明,淇河鲫与同目的鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼的同源性分别为98.6%、96.2%、91.5%和88.6%;与不同目的胡子鲇和鳗鲡的同源性分别为74.6%和49.5%;与哺乳类的家鼠和人等的同源性低于40%.图3参30     

斑马鱼p53基因结构比对分析及其在生态毒理学中的应用

斑马鱼p53基因由11个外显子和10个内含子组成,外显子1和外显子11部分序列不参与编码蛋白质．其 cDNA核苷酸序列共2089bp,包含一个1122 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)(44 bp-1165 bp),这个 ORF编码373个氨基酸．另外在3’端有924 bp是非翻译区(3’-UTR),5’端同样也存在43 bp的非翻译区(5’- UTR);12种脊椎动物p53氨基酸序列的保守性分析结果表明,在一些特殊的区域,12种氨基酸序列表现出了很高的保守性,这些区域和p53的抑癌功能密切相关．研究结果预示斑马鱼p53基因是一种理想的环境致突变物研究分子模型,在生态毒理学研究中具有良好的应用前景．     

麻疯树叶绿ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱胞和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列.对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1 368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量(Mr)大小为52.1×103.同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性.RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达.此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能.对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累.上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶.     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

Isolation and sequence of cDNA encoding a 3-methylcholanthrene-inducible cytochrome P450 from wild red sea bream,Pagrus major

We have isolated a cDNA clone of mRNA for the cytochrome P450 from a 3-methylcholanthrene (MC)-treated red sea bream,Pagrus major, using a cDNA fragment for rat P4501A2 as a probe. The cloned cDNA is ca. 1.8 kb long and contains an open reading frame of 1545 nucleotides for polypeptides of 515 amino acids. The deduced N-terminal amino acid sequence of the cDNA is very similar to that for purified cytochrome P450 protein from the marine fish scup, which was reported previously (Klotz et al. 1983). A conserved amino acid sequence containing a putative heme-binding cysteine is present in the equivalent position proximate to the C-terminus of the molecules. The deduced amino acid sequence shows more than 50% positional identity with known members of the mammalian aromatic hydrocarbon-inducible P450 family. RNA blot analysis indicates that P450 mRNA (s) is expressed in the liver, kidney, gill and gut of the MC-treatedP. major.     

团头鲂谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及其在氨氮胁迫中的表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类多功能蛋白家族,主要参与解毒和抗氧化防御过程。为了研究GST在团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏解毒过程中的作用,克隆并分析了团头鲂1个谷胱甘肽S-转移酶基因(命名为MaGST)cDNA序列,采用实时荧光定量PCR研究了其在氨氮胁迫下的表达规律。MaGST包含1个长218个氨基酸的完整开放阅读框,具有GST蛋白家族的保守碱基和保守结构域。通过MEGA 5.0软件分析系统进化树发现,团头鲂GST与其他动物mu型GST聚为一簇,表明团头鲂GST属于mu型GST。荧光定量PCR结果显示MaGST基因在团头鲂各组织中均有表达,在肝脏和鳃中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在氨氮胁迫过程中该基因在肝和鳃中的表达规律相似,均在胁迫期间表达量显著上调;氨氮胁迫24 h时鳃和肝组织均存在组织损伤。研究结果提示在团头鲂肝脏和鳃组织中GST基因参与了氨氮胁迫的解毒过程。将该基因的编码区重组到p ET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达,重组MaGST的GST活力为(10.36±0.68)U·mg~(-1)蛋白。     

D.radiodurans kat A和kat B基因的结构分析与功能鉴定

以简并引物PCR获得的Cat酶基因片段探针，结合生物信息学方法，探明了耐辐射奇球菌（D.radiodu-rans)基因组中存在两个编码过氧化氢酶（Catalase,Cat)的基因：katA和B.katA和katB基因长2277bp和1611bp，各编码758和536个氨基酸，用pKK223-3表达载体连接katB基因，转入Cat酶缺陷型大肠杆菌（E. coliUM2)进行表达.katB基因表达产物具有Cat酶活性，电泳迁移位置与D.radiodurans CatB酶位置相符，并可重建E.coliUM2对低浓度H2O2损伤的耐受力。