光合细菌PCR检测技术的建立与应用

针对光合细菌传统的菌种鉴定方法和MPN定量方法存在费时、费力和准确性筹的问题,本研究建立了光合细菌特异PCR鉴定技术和实时荧光PCR定量的检测技术.以微生物肥料产品常用的光合细菌沼泽红假单胞菌和类球红细菌作为研究对象,分别依据16S rDNA序列和gyrB序列设计出具有种水平特异性的引物,优化并确定了PCR反应条件,其灵敏度达到100 pg/μL,对6个光合细菌产品鉴定的符合率为100%,结果表明建立的PCR鉴定技术具有特异性、灵敏性和实用性.再根据16S rDNA的保守序列设计了常用光合细菌通用引物,用其对系列稀释的已知菌含量样品的DNA模板进行荧光定量PCR,制作标准曲线.对10个光合细菌样品进行荧光定量PCR法测定,根据与标准曲线比较得出样品中的光合细菌含量,其结果与MPN法的相关系数为0.98,两者具有良好的相天性,结果表明建立的荧光定量PCR法可用于光合细菌的定量检测,并具有高特异性和快速等优点.     

马氏珠母贝hsp90基因的克隆及芘胁迫对其表达水平的影响

利用简并引物PCR(polymerase chain reaction,PCR)方法和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得马氏珠母贝Pinctada martensii hsp90基因cDNA序列,全长为2 584 bp。根据所得序列设计定量特异性PCR引物,采用半定量RT-PCR以及实时荧光定量(real-time PCR)PCR检测了马氏珠母贝外套膜、鳃、肝胰腺、闭壳肌、性腺、腹足等组织中hsp90基因的表达水平。同时,利用荧光定量PCR技术检测了芘暴露处理前后马氏珠母贝肝胰腺组织中hsp90基因的表达水平。研究结果表明:马氏珠母贝hsp90基因在不同组织中的表达水平为性腺鳃肝胰腺外套膜腹足闭壳肌,表现出组织差异性。芘胁迫对马氏珠母贝hsp90基因的表达有一定的诱导作用,暴露后第1天和第5天,随染毒浓度的增加,hsp90基因的表达上调,呈现出一定的剂量-效应关系,于染毒后第7天基本恢复。研究结果显示,马氏珠母贝hsp90基因可以作为一种理想的分子生物标记物用于监测海洋环境中芘的污染。     

松材线虫PCR标准化阳性对照构建及检测体系的建立

建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196 bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100 ps/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.图3表2参8     

抗除草剂转基因作物实时荧光定量PC检测

建立了一种以SYBR Green Ⅰ为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法.以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green Ⅰ结合染料实时荧光定量PCR技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测,绘制了两种基因扩增的标准曲线图,根据标准曲线方程计算外源基因含量;并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析.研究发现,两者标准曲线方程线性关系良好.R~2 值分别达到0.993 9与0.992 4.通过已知标准品进行验证,实测值与真值接近,与实际含量的相埘偏差是6.52%和7.90%.结果表明,SYBR Green Ⅰ结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR检测.图5表2参11     

焦化废水生物膜样品和苯酚降解菌分离株基因盒的分析

使用59-碱基(59be)保守序列和整合酶基因的引物进行PCR扩增,研究了焦化废水处理装置中微生物菌群的基因盒结构,并对两株分离的苯酚降解荫IS-17和IS-46的基因盒进行了扩增测序分析.从5个焦化废水生物膜总DNA样品中均获得了基因盒扩增产物.对IS-17和IS-46的基因盒PCR产物克隆建库并测序,通过序列比对等方法来研究和分析序列的功能.发现本研究获得的基因盒与已报道的基因盒存读码框序列、两端引物结合序列、间隔区大小等方面存在一些不同.本研究结果表明,在焦化废水生物膜菌群中普遍存在基因盒结构,采用基因盒PCR能够从环境或菌株中获取新基因.     

长链烷烃降解菌alkB片段的分离和鉴定

分离并鉴定了长链烷烃降解菌Pseudomonasaeruginosa1785和P.marginata766烃羟化酶基因alkB片段.根据烃羟化酶的保守氨基酸序列,设计兼并引物,扩增P.aeruginosa1785和P.marginata766的alkB片段,获得了目标产物.经DNA测序和氨基酸序列分析,证实目标片段编码的肽段含有烃羟化酶的特征基序.由此确认采用该方法分离到了长链烷烃降解基因的alkB同源体片段.DNA序列比对结果表明,P.aeruginosa1785和P.marginata766的alkB片段与P.aeruginosaPAO1的alkB1和alkB2的相似性分别达到95.7%和94.8%.这些alkB片段可用于分析烃降解微生物群落结构.图3表2参11     

林木外生菌根真菌彩色豆马勃巢式PCR检测

为探讨林木外生菌根真菌的分子检测方法,利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B扩增了外生菌根真菌彩色豆马勃的核糖体DNA内转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对彩色豆马勃特异性引物PtF/PtR.利用该对特异性引物与ITS1-F/ITS4-B组合进行巢式PCR,能从供试的彩色豆马勃10个菌株中特异性地扩增出1条347 bp的条带,而供试的其他6个参比菌株未出现扩增产物.经分析,该巢式PCR检测技术的灵敏度可达到10 fg的DNA,是常规PCR检测的1 000倍.利用该技术从马尾松苗木菌根中检测到目的外生菌根真菌.这表明采用本研究设计的特异性引物,利用巢式PCR技术可以灵敏、准确地从林木外生菌根中检测出彩色豆马勃.     

高浓度含油废水中不同组分烃的生物强化去除特性

为探究石油烃降解菌群对高浓度含油废水中不同组分烃的生物降解特性,向含油水相中接种石油烃降解菌群LW-10(Accession number:SRR15082184)进行降解实验.利用GC-MS研究了LW-10对原油中不同组分烃的降解性能,采用流式细胞术检测降解体系中的菌量变化.利用qPCR技术对控制不同组分烃降解的关键基因进行检测.结果表明,原油浓度为5000 mg·L^-1的含油废水中接种LW-10降解17 d,对原油中烷烃和多环芳烃组分的降解率分别为96.7%和28.4%.体系中的降解菌总浓度与高活性菌浓度由接种时的1.0×10⁸ cfu·mL^-1增加至2.1×10⁹ cfu·mL^-1和8.3×10⁸ cfu·mL^-1.检测的3种石油烃降解功能基因中,烷烃单加氧酶基因alkB2拷贝数由1.06×10⁸ copy·mL^-1变为2.84×10⁸copy·mL^-1...     

石油烃降解酶及其基因的结构、功能和表达调控

研究烃降解酶及其基因是进行石油微生物分子检测和工程菌构建的重要基础.本文对目前烃降解酶及其基因的结构、功能和调控机制的最新研究进展进行了总结.催化烷烃好氧降解的起始酶有几类加氧酶,膜整合甲烷单加氧酶、萘-1,2-双加氧酶和异丙苯双加氧酶的晶体结构已经被解析.烷基或芳基琥珀酸合酶催化烃厌氧代谢的主要起始反应,而Azoarcus sp.乙苯厌氧代谢起始反应由乙苯脱氢酶催化.在细菌中,烃代谢相关基因主要通过形成操纵子进行表达调控,基因转录受烃或类似物诱导,并受细胞全局调控.一些微生物由于存在多种烃代谢途径而可能具有复杂的基因调控机制.此外,生态学研究表明,环境中烃降解基因的诱导动态与实验室内纯培养分析不同.在分析石油降解工程菌构建有待解决问题的基础上,提出了烃代谢综合调控和环境中相关酶及基因诱导研究的重要性,并对未来烃降解酶及其基因在有毒物降解理论研究和生物修复上的应用进行了展望.     

环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究

环境DNA(eDNA)宏条形码(Metabarcoding)技术越来越多地被应用于环境中物种定性识别,但如何定量监测物种在环境中的丰度尚未得到解决。本研究以太湖流域常见的5种浮游动物拟同形溞、大型溞、蚤状溞、多刺裸腹溞、老年低额溞为研究对象,建立了一种基于eDNA宏条形码技术的物种定量方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)相比较,研究了eDNA宏条形码技术多物种定量的准确性。结果表明,PCR引物对eDNA宏条形码的物种检测和定量影响显著。313 bp COI313引物对浮游动物物种覆盖度高,但是物种间DNA扩增的偏好性大,不适用于eDNA宏条形码定量检测。基于COI序列重新设计的短COI116引物能够同时检测出所有5个物种。荧光定量PCR(qPCR)物种拷贝数与物种相对占比呈正相关。eDNA宏条形码所检出每个物种的序列数与qPCR定量拷贝数高度一致。综上,eDNA宏条形码技术可实现对浮游动物物种的半定量检测,在生物多样性监测和生物完整性评价有显著的应用价值。     

氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增效率、灵敏度和特异性的影响

以人类基因组DNA和志贺氏菌粗制裂解菌液为模板,扩增115 bp的Alu基因片段和402 bp的ipaH基因片段.通过设置氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)和模板的浓度为变量,分别研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增效率和灵敏度的影响;运用多轮PCR扩增方法研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增特异性的影响.结果显示,氧化石墨烯有效提高PCR扩增效率的范围为9—14倍,提高PCR灵敏度一个数量级以及增加多轮PCR扩增中的两轮扩增反应.从原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)的结果可以看出,本文制备的氧化石墨烯片层厚度主要集中在0.5—0.8 nm,少数大于1 nm,总体具有较大的比表面积.除此之外,本文还发现当氧化石墨烯浓度到达μg·μL~(-1)后,引物二聚体与氧化石墨烯的浓度呈正比,说明氧化石墨烯优化PCR的主要影响因素是其与引物的相互作用.     

添加不同营养助剂对石油污染土壤生物修复的影响

实验室条件下研究NPK复合肥、诺沃肥和腐殖酸三种物质不同配比添加对石油污染土壤的生物修复效果.在60d的修复实验中,定期取样测定土壤含油量、总异养菌数、石油烃降解菌数和脱氢酶活性,并采用PCR-DGGE技术研究修复过程中微生物多样性变化.结果表明,NPK肥的添加和NPK肥-诺沃肥-腐殖酸复合添加能够提高土壤中微生物的数量、微生物多样性和脱氢酶活性.在含油量为84600mg.kg-1的土壤中,添加营养助剂的处理60d后石油烃降解率为31.3%—39.5%,不添加营养助剂的石油烃降解率仅为3.5%.NPK肥-诺沃肥-腐殖酸复合添加对石油烃的降解率要高于NPK肥的单独添加(高8%),其原因可能是诺沃肥-腐殖酸能够有效提高土著微生物的活性,增加微生物的多样性,增强石油烃的降解.     

石油污染土壤的微生物修复及土壤微生物活性变化

为快速有效地测定石油污染土壤中功能性微生物的活性变化,分别以石油烃、正十六烷烃、多环芳烃为自定义碳源,应用Biolog法研究油污土壤生物修复过程中石油烃、烷烃、多环芳烃降解菌的代谢活性.结果显示,向油污土壤中投加混合降解菌群进行生物强化修复处理,可以有效去除土壤中的石油烃,修复13周土壤中石油烃去除率达到42.3%;生物刺激和自然修复对土壤石油烃的去除率分别为28.3%和20.5%.Biolog测定结果表明,生物强化法修复初期的土壤微生物群落对石油烃、烷烃两种碳源的代谢能力较强,而生物刺激法修复后期的土壤微生物群落对烷烃有较强的代谢能力;不同处理的土壤微生物群落比较偏好、利用率较高的碳源是石油烃,其次是烷烃,而对多环芳烃几乎不利用;土壤中石油烃、烷烃降解菌的活性越大,土壤微生物对石油烃的去除效率越高.上述研究结果说明,通过利用Biolog法测定土壤微生物活性变化可有效指示土壤中石油烃的去除效果.     

食蚊鱼(Gambusia afinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生态毒理学中的应用

根据Ensembl、Genbank登录的鱼类cat、gapdh和gst基因的CDS序列设计普通PCR扩增引物,寻找食蚊鱼的cat、gapdh和gst基因的c DNA片段,并根据定量引物设计要求设计出相应的SYBR Green I荧光定量RT-q PCR引物,建立了食蚊鱼cat、gapdh和gst基因的SYBR Green I荧光定量RT-q PCR方法。该方法在104~108数量级范围内有良好线性关系(R=0.999~1.000);熔解曲线显示扩增产物特异性良好,均为单一峰值;质粒标准品最高浓度与最低浓度的批内试验变异系数与批间试验变异系数均低于2%。利用该方法监测和评价环境污染物对水生生物的影响,选择了水体中常见典型药物污染物——双氯芬酸,研究其对食蚊鱼抗氧化基因表达的影响。结果表明,雌性食蚊鱼暴露在不同浓度双氯芬酸钠(0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1)24 h后,其肝脏cat、gapdh和gst的mRNA呈现显著变化,相对于对照组,在低浓度0.005 mg·L-1时,cat与gst mRNA的表达量均有极显著上升(p0.01),而其它浓度均极显著下降(p0.01)。试验表明该方法具有快速、精确、灵敏度高的优点,可为利用该类小型鱼类的原位污染物的生物监测和生态毒理评价提供有力的技术支持。     

甘蔗SCoT-PCR反应体系优化与多态性引物筛选及应用

目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种新型的标记,结合了ISSR标记和RAPD标记的优点.本研究针对SCoT-PCR反应体系的影响因素,以甘蔗叶片DNA为材料,在单因子实验的基础上,采用L16(45)正交实验设计,进一步探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶等5个因素对甘蔗SCoT-PCR扩增效果的影响,建立了甘蔗SCoT-PCR的优化反应体系.25μL PCR反应混合液中,含50 ng DNA模板、2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、0.625 U Ex Taq酶,dNTP和引物的终浓度分别为0.22 mmol/L和0.9μmol/L.以我国种植面积最大的栽培品种新台糖22号为模板,应用优化体系,对40条SCoT标记引物进行测试,筛选出16条有效扩增的引物,且均为多态性引物,其GC含量在50%～67%之间.该体系的稳定性和SCoT标记引物的扩增能力,通过基于随机选择的4条引物对9份具有地理来源和遗传背景不同的甘蔗种质进行标记分析来验证,结果共扩增出84条带,其中多态性条带占82.14%,平均单条引物可扩增出21条.研究结果为在甘蔗上进一步开发和应用功能性SCoT标记奠定了基础.     

石油污染与微生物群落结构的相互影响

从两种土壤中分别分离出石油烃降解菌,并从中筛选出6株石油烃高效降解菌A1、A2、A6、A8和B2及B5,然后将各菌株鉴定至属,分别为A1假单胞菌属、A2鞘氨醇单胞菌属、A6微球菌属、A8节杆菌属、B2不动杆菌属和B5诺卡氏菌属。另外对比分析了单菌株及不同菌株重组对不同石油烃组分的利用情况,结果发现,从不同石油污染的土壤中分离到的菌株对石油烃组分的利用能力不同,从胜利原油污染的土壤中分离到的菌株A1、A2、A6和A8对石油烃组分的利用范围窄,主要利用饱和烃组分;而从经芳香烃驯化过的土壤中分离到的菌株B2及B5对石油烃利用组分的利用范围较宽,能同时利用饱和烃和芳香烃组分。     

褐菖鲇肝HSC70基因的环介导等温扩增技术的建立及在石油污染剂量效应研究中的应用

从褐菖鲉肝脏中克隆了热休克蛋白HSC70基因,利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立HSC70基因的定量检测方法.为检测该方法的可行性,将褐菖鲉分别暴露于石油水溶性成分(water-soluble fraction,WSF) 20、60、180 μg·L-11d后,利用real-time PCR及LAMP技术同时测定褐菖鲉肝HSC70 mRNA表达量,两种方法测定结果基本一致,证实LAMP技术可用于褐菖鲉肝HSC70基因的定量.为更细致了解石油WSF影响褐菖鲉肝脏HSC70基因表达的剂量-效应关系,将褐菖鲉分别暴露于25、50、75、100、125、150、175 μg·L-1 WSF中,5d后采样,用LAMP技术定量检测HSC70 mRNA.结果表明,HSC70 mRNA表达量在50 μg· L-1浓度组即被显著诱导,在75μg·L-1浓度下达到最大值,这说明褐菖鲉肝HSC70基因对石油污染较敏感,有潜力作为海洋石油污染的生物标志物.     

石油烃厌氧生物降解代谢产物研究进展

石油烃厌氧生物降解代谢产物的分析对于石油烃厌氧降解机制的研究、功能微生物的筛选以及微生物活动的原位监测具有指示性作用.综述了近年来石油烃厌氧生物降解代谢产物的研究进展.石油烃厌氧降解的初始活化方式主要包括脱氢羟基化、加延胡索酸以及羧化等.其中,加延胡索酸是不同种类的微生物通常采用的代谢方式.同时,将代谢产物按照气体、无机离子和有机酸进行分类,并针对各类物质特别是瞬时性、低浓度的有机酸类产物常采用的分析方法进行归纳.通过实例强调了代谢产物作为潜在生物标记物的应用,并对石油烃厌氧降解代谢产物分析方法的发展提出展望.图3参58     

一株菲降解菌的特性及相关降解基因的克隆

从石油污染土壤中分离到一株菲降解菌2F5-2.根据该菌株生理生化特征和16S rDNA序列相似性分析,将其初步鉴定为鞘氨醇杆菌属(Sphingobium sp.).该菌株在10 h内对100 mg/L的菲的降解率为100%.降解菲的最适温度为30℃,最适pH为7.对降解途径的初步研究显示,该菌株通过水杨酸途径降解菲.克隆了编码芳香烃双加氧酶α亚基的基因phdA,它与菌株Sphingomonas sp.P2、Sphingobium yanoikuyae B1、Sphingomonas sp.ZP1中phdA的同源性分别为97.9%、98%和100%,表明该基因具有保守性.图6参16     

转基因毛白杨外源基因转移的环境风险分析

以8年生转Bt基因败育毛白杨雄株为实验材料,分离其体内、体外、根际土壤、蛀干桑天牛(Apripona germari Hope)排泄物中可培养的细菌和真菌,利用特异引物对获得的微生物进行转Bt基因败育毛白杨雄株外源基因PCR检测.实验发现,381株次细菌中有6株PCR检测阳性;307株次真菌中有4株PCR检测阳性.