基于产毒基因sxtA的qPCR方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中的应用初探

麻痹性贝毒(paralytic shellfish toxins)包括石房蛤毒素(saxitoxin)及其同系物,是一类具有神经毒性的生物毒素,主要由甲藻和蓝藻产生。近年来,在蓝藻和甲藻中相继发现了一些与石房蛤毒素合成密切相关的基因,并建立了基于特定产毒基因的有毒藻类检测方法。长江口邻近海域是我国近海有害藻华的高发区,本研究尝试应用基于麻痹性贝毒产毒基因sxtA的qPCR检测方法,与有毒塔玛亚历山大藻复合种(I型和IV型)的qPCR检测方法和麻痹性贝毒的高效液相色谱方法相结合,对2013年春季长江口邻近海域两条断面上有毒藻和藻毒素的分布及变动情况进行了分析。结果表明,基于sxtA的qPCR检测结果与IV型塔玛亚历山大藻复合种的数量存在较好的相关性(r2=0.52,P0.05),说明IV型塔玛亚历山大藻复合种是采样期间长江口邻近海域麻痹性贝毒的主要来源;而样品中藻毒素含量与两种qPCR方法得到的有毒藻数量之间并没有明显相关性。可见,基于产毒基因的检测方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中具有一定优势,但不足以准确反映该海域藻毒素的水平。     

我国近海有毒微藻及其毒素的分布危害和风险评估

近年我国海域有害赤潮频发,赤潮优势种的变化显著,最近7a记录了51种引发赤潮的优势赤潮生物,其中由有毒微藻引发的赤潮增加。有毒微藻在我国海域广泛分布,至少3个株产麻痹性贝毒的亚历山大藻,5种能产生腹泻性贝毒软海绵酸毒素和鳍藻毒素、以及扇贝毒素的鳍藻在我国沿海都有分布;产生虾夷扇贝毒素的三种甲藻在北黄海常年存在。我国多种贝类中已发现麻痹性贝毒、软海绵酸毒素和鳍藻毒素、扇贝毒素、虾夷扇贝毒素和环亚胺毒素等多种微藻毒素。本文较系统的归纳综述了我国有害赤潮、优势种的变化趋势和分布特点,产生的藻毒素结构;我国双壳贝类等海洋生物中存在的微藻毒素的种类结构;首次利用风险商值法研究评估了我国贝类的健康风险。结果表明,只有春季来自福建的2个样品具有食用风险;但大连海区的贝类样品、评估值全都接近安全限值,可能表明具有某种区域性风险;在春末夏初,大窑湾的贻贝风险最大,其次是扇贝,牡蛎的风险最小;不同的贝器官,富集藻毒素的能力差别大,消化腺中的藻毒素含量远高于其它器官,不同的食用方式可能会导致不同的中毒风险。总体上,我国沿海常见种双壳贝类的麻痹性贝毒和虾夷扇贝毒素食用风险低。     

嵊泗列岛养殖区的赤潮麻痹性贝毒检测

通过两年赤潮生物调查和赤潮麻痹性贝毒小鼠测定,结果显示1990和1991年嵊泗列岛养殖区其出现6次以上赤潮;水产品含麻痹性贝毒极低,小于0.875×10-3Mu/q组织,符合食品卫生要求;菱形裸甲藻(Gymnodinium rhomboides)可能是有毒 赤潮生物,该藻密度达106个L以上,经一潮汐周期污染的紫贻贝含毒量可使试验小鼠出现呼吸急促,后肢瘫痪现象。该区潜在发生有毒赤潮的危险,6～9月应进行监测。建议用小鼠生物测定法和紫贻贝作材料进行赤潮麻痹性贝毒监测。     

赤潮毒素研究进展

近年来,赤潮是全球最严重的海洋生态灾害之一,在我国也尤为突出.本文就赤潮毒素麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、记忆缺失性贝毒、神经性贝毒,以及两加鱼毒的分布特征、产毒藻类、化学组分与结构、毒素转化、致毒机理、食用标准、检测方法等国内外研究进展,进行系统的论述,为我国的赤潮监测和灾害防治提供参考.     

辽东湾毒害微藻潜在风险分布及环境关联

以18S rDNA V4区作为目标基因,利用自行设计的真核浮游植物鉴定引物V4（F/R）,结合高通量测序技术,对辽东湾2014年四季海水中真核藻类多样性进行了检测.结果发现了辽东湾毒害藻类共29种,曾引发赤潮或褐潮的种类有19种,可导致鱼类大规模死亡的有8种,主要为甲藻门.有18种疑似为辽东湾新记录种,其中9种在中国海域未见报道;发现麻痹性贝毒（PSP）产毒藻8种,腹泻性贝毒（DSP）产毒藻2种,产虾夷扇贝毒素（YTX）产毒藻3种,神经性贝毒（NSP）产毒藻2种,溶血毒素（hemolysin）产毒藻13种,另外还有1种褐潮产毒藻（EPS）.辽东湾检出的毒害藻类中有8种自养型、1种异养型、20种混合营养型藻类.麻痹性贝毒、虾夷扇贝毒素、溶血毒素在夏季风险较高,神经性贝毒在秋季风险较高,腹泻性贝毒在春、夏季风险均较高,辽东湾东西两岸是贝毒风险高发区.辽东湾春季水温对YTX、NSP产毒藻影响显著负相关;夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd对各产毒藻类影响显著正相关;秋季各环境因子对各产毒藻类影响不显著;冬季Zn、As、Oil、DIN对各产毒藻类影响显著正相关,水温对各产毒藻类影响显著负相关,各产毒藻类与环境因子关联性有待于进一步研究.     

海洋赤潮毒素对鱼类的毒害

介绍了上前产生鱼毒素（ｉｃｈｔｈｙｏｔｏｘｉｎ）的主要海洋藻类,现有的研究结果表明：鱼毒素主要包括：麻痹性贝毒（ＰＳＰ）、短裸甲藻毒素（ＢＴＸ）、溶血性毒素（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｔｏｘｉｎ）、细胞性毒素（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）和氨等。１９９７年底在南海东部海域及１９９８年春在珠江口和香港海域爆发的大规模赤潮即为能产生鱼毒素的球状棕囊藻（Ｐｈａｅｏｃｙｓｔｉｓｃｆ．ｇｌｏｂｏｓａ）和米氏裸甲藻（Ｇｙｍ     

大鹏澳海域麻痹性贝类毒素时空动态变化特征

为了掌握广东大鹏澳海域产麻痹性贝毒（paralytic shellfish poisoning,PSP）藻类的分布状况和贝类染毒情况,于2013年8月至2014年10月在广东大鹏澳海域的牡蛎养殖区、牡蛎养殖外区及湾口海域逐月采集水样以及牡蛎样品进行分析。调查结果显示,大鹏澳海域的牡蛎养殖外区和湾口存在塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarensis）,链状亚历山大藻（A. catenella）和链状裸甲藻（Gymnodinium catenatum）三种PSP产毒藻,但密度较低,时间分布不连续,牡蛎养殖区未发现产PSP毒素藻类。在季节分布上,产毒藻呈现冬季检出率低,春秋季高的特点。在大鹏澳牡蛎样品中共检测出8种PSP成分,分别是GTX1、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2,贝类中PSP的检出率冬季最高,达66.7%,秋季、夏季次之,春季最低。PSP产毒藻和贝类染毒在时间上不完全同步,贝类染毒率最高的时间晚于PSP产毒藻最高密度出现时间。     

腹泻性贝毒的研究概况

本文介绍了日本等国家沿海地区人们食用贝类引起的腹泻性贝毒的概况。由倒卵形鳍藻和渐尖鳍藻使贻贝、海扇和扇贝等多种贝类染毒,食后产生以恶心、呕吐、腹泻和腹痛为特征的食物中毒,称为腹泻性贝毒。其毒素的主要成分为鳍藻毒素-1(DTX1),DTX1对小鼠腹腔注射的最小致死量为160μg·kg～1,对人的最小中毒量为32μg。 日本学者认为鳍藻引起的腹泻性贝毒,在日本和世界各地均有发生食物中毒的可能。     

紫贻贝体内麻痹性贝毒在自然条件下的排出

2009年4月中旬在大连大窑湾海域采集了750只含麻痹性贝毒的紫贻贝吊养于大连棋盘磨附近海域,使其体内麻痹性贝毒在天然海域内自净。研究结果表明:试验所用紫贻贝软体部中麻痹性贝毒以N-磺酰氨甲酰基类毒素C1/C2和膝沟藻类毒素GTX2/3为主,其中后者占总毒素的65.08%,且降解速度较快;消化腺中毒素成分复杂,毒素含量高,是紫贻贝体内麻痹性贝毒的主要富集器官,在排出过程中毒素含量变化复杂;紫贻贝闭壳肌中毒素成分以新石房蛤毒素neo-STX为主,占总毒素含量的96.59%,其在试验过程中并没有明显降低趋势,反而波动上升,实验结束时其含量增加了34.75μgSTXeq/100 g;在性腺、鳃、外套膜中没有检测到任何形式的麻痹性贝毒成分。     

福建三都湾赤潮监控区的麻痹性贝毒和腹泻性贝毒研究

运用美国分析化学家协会(AOAC)推荐的小白鼠生物测定法，对三都湾赤潮监控区的经济贝类于2003年5月．10月进行每月1次的麻痹性贝毒(PSP)和腹泻性贝毒(DSP)含量检测。结果表明：在此期间均未检测出PSP；DSP于7、8、10月在紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)体内检出，其中10月检出DSP含量为10Mu／100g，超标。     

杉木粉对两种赤潮藻去除的试验研究

利用船基围隔试验,探讨了杉木粉对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)两种赤潮藻的去除效果.并以斑马鱼(Brachydanio rerio)和卤虫无节幼体(Artemia sinica)为材料,对杉木粉及其有效成分杉木精油的毒性进行了测试.结果显示,杉木粉用量为76.9 mg/L时具有显著去除米氏凯伦藻的作用;浓度为38.4mg/L时可显著去除东海原甲藻.杉木粉对斑马鱼的24 h、48 h半致死浓度分别为2.8 g/L、2.4 g/L,安全浓度为0.6 g/L.利用杉木粉控制赤潮有一定的应用前景.     

福建沿海米氏凯伦藻赤潮对皱纹盘鲍的危害原因

针对2012年在福建沿海致鲍鱼大量死亡、造成了巨大经济损失的米氏凯伦藻赤潮,为验证鲍鱼短时间内大量死亡的原因是否来源于米氏凯伦藻自身的毒性效应,本文初步研究了不同环境条件下,分离自赤潮现场的一株米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)的急性毒性效应。实验过程中,监测了曝气与非曝气条件下,环境因素中氨氮(TAN)、pH、DO的变化。研究发现,曝气条件下,实验体系中DO的变动范围为7.3~7.8 mg/L,pH的变动范围为7.5~8.2,TAN浓度的变动范围为0.0035~0.084 mg/L(能维持贝类正常生存),此时米氏凯伦藻趋近于赤潮现场藻细胞数量时(3107/L),鲍鱼48 h死亡率为33.3%,96 h内死亡率达100%,说明此时鲍鱼的急剧死亡是由米氏凯伦藻本身的毒性效应引起的。在非曝气条件下, DO由7.1 mg/L降低至1.8 mg/L,实验体系中pH的变动范围为7.2~8.1,TAN的变动范围为0.007~0.051 mg/L,此时米氏凯伦藻藻细胞数量为3107/L时,鲍鱼16 h内死亡率达100%,说明低氧的环境条件可以导致赤潮对鲍鱼的毒性效应加剧。由此可以推测,赤潮发生时皱纹盘鲍短时间内的大量死亡与米氏凯伦藻本身的毒性效应有关,而低氧等环境条件可以导致毒性效应加剧。     

有害甲藻米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）对海洋青鳉鱼（Oryzias melastigm）的急性毒性效应研究

米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）是我国近岸海域常见的有毒有害藻华肇事种,能产生多种毒素,其发生藻华时会使大量鱼类或贝类死亡。本研究从细胞生物学、氧化和免疫酶活性角度研究米氏凯伦藻对海洋青鳉鱼（Oryzias melastigma）的急性毒性效应（72 h）,以期揭示米氏凯伦藻对鱼类的致死原因。组织切片结果表明,高浓度的米氏凯伦藻[（1.37～1.52）×107 cells/L]可以导致海洋青鳉鱼鳃丝断裂,成团状与相邻鳃丝融合,鳃丝上皮细胞的细胞核发生偏移,并使肝细胞出现空泡化现象。高浓度的米氏凯伦藻能够抑制海洋青鳉鱼的鳃和肝组织的SOD酶活性和CAT酶活性,引起海洋青鳉鱼脂质过氧化,导致丙二醛（MDA）含量升高,对组织造成损伤。本研究结果表明,米氏凯伦藻可能通过氧化应激反应使海洋青鳉鱼的鳃和肝组织受损,为深入阐明米氏凯伦藻的毒性机制提供参考。     

几种典型有害藻对皱纹盘鲍急性毒性及其抗氧化酶活性的影响

为更好地了解有害藻华对鲍的影响及其原因,本文选择米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）、链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）、东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和抑食金球藻（Aureococcus anophageffferens）4种典型有害藻,开展对皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）的急性毒性及其成体抗氧化酶活性研究。研究发现,米氏凯伦藻和链状亚历山大藻均可致皱纹盘鲍幼虫、幼鲍和成体死亡。在米氏凯伦藻藻华现场密度下（5000/mL）,皱纹盘鲍幼虫的致死效应最显著,96 h时的存活率为4.7%。暴露在4000/mL藻密度链状亚历山大藻中,96 h时幼虫存活率为25.5%,暴露在10000/mL藻密度链状亚历山大藻中,48 h时幼鲍和成体存活率降至3.3%和6.7%。东海原甲藻和抑食金球藻对幼鲍和成鲍没有急性毒性影响,但能够降低皱纹盘鲍幼虫的存活率。米氏凯伦藻和链状亚历山大藻能够抑制皱纹盘鲍鳃的SOD酶活性和CAT酶活性、肝胰组织的SOD酶活性和GSH-Px酶活性,对皱纹盘鲍免疫系统造成损伤,而东海原甲藻和抑食金球藻对鲍体内的3种抗氧化酶活性的影响不明显。以上结果表明,米氏凯伦藻和链状亚历山大藻藻华能对鲍养殖产业造成严重威胁,东海原甲藻和抑食金球藻藻华可对鲍的资源补充存在不利影响。     

光照、温度和氮磷限制对6种典型鱼毒性藻类生长及产毒的影响

为了探究温度、光照、和营养盐对鱼毒性藻类产毒的影响,本文分析了6种我国沿海典型具溶血活性的鱼毒性藻类在不同温度(15℃,25℃,30℃)、光照强度(20 mol/m2/s,60 mol/m2/s,100 mol/m2/s)、氮磷限制(1:1;1:16;1:128)条件下的生长和溶血活性的变化。结果表明,鱼毒性藻类的溶血活性在不同生长期差异明显。海洋卡盾藻(香港株)(Chattonella marina)、卵圆卡盾藻(C.ovata)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)在对数期溶血活性较高,衰亡期溶血活性较低,而球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)与小定鞭藻(Prymnesium parvum)在稳定期溶血活性最高,对数期溶血活性最低。藻类的培养环境和营养条件对鱼毒性藻类溶血毒素的合成有明显的影响,在光照强度、温度和氮磷限制条件下,藻类单个细胞的溶血活性会发生明显变化,6种藻类的溶血活性均随光照强度的升高而增强,在培养温度15~30℃范围内,除球形棕囊藻外,其他5种藻类的单个藻细胞溶血活性随温度的上升而增加,氮磷限制可促进溶血毒素的合成。     

磺胺嘧啶和盐酸四环素对四种赤潮藻生长的影响

本文以锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）、米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）、球形棕囊藻（Phaeocystis globosa）、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）为研究对象,实验室条件下对比研究了磺胺间二甲氧嘧啶钠（SMS）和盐酸四环素（TC）暴露下4种赤潮藻的细胞增长、光合色素组成以及最大光能转化效率（Fv/Fm）等的变化规律。研究结果表明:4种赤潮藻在SMS和TC（7.5～240 mg/L）暴露组细胞密度均未出现半抑制效应,SMS对4种赤潮藻细胞密度的最大抑制效应范围为5.47%～36.26%,略高于TC的最大抑制效应0～35.21%（球形棕囊藻无抑制效应）;藻细胞叶绿素含量在抗生素暴露下均显著下降,但作为抗氧化剂和捕光色素的类胡萝卜素含量则显著增加;低浓度（<50 mg/L）TC暴露下,4种赤潮藻Fv/Fm均显著下降;TC（<30 mg/L）暴露下,4种赤潮藻细胞密度最大促进作用范围为11.30%～38.89%,球形棕囊藻细胞密度增加比例最高;赤潮藻对抗生素的响应存在显著的种间差别,两种抗生素暴露对球形棕囊藻生长的抑制效应明显低于其他3种赤潮藻,高浓度抗生素残留对浮游植物群落演替存在较强的干扰作用。     

pH对米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)种群生长、营养吸收及无机碳亲和力的影响

随着海水酸化以及沿海赤潮爆发诱发水体pH的上升,pH对海洋藻类生理生态影响逐渐为人类所关注。本实验以东海常见赤潮藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)为研究对象,研究不同pH对其生理状态的影响。结果显示,pH对米氏凯伦藻的生长、营养吸收、叶绿素、光合速率以及对无机碳的亲和力存在显著影响。当pH=6.2时,米氏凯伦藻的生长受到抑制,细胞生长速率,营养盐吸收率,最大光合速率以及对无机碳的亲和力都最低;当 pH=8.2时,细胞的生长最快,对营养盐的吸收也最快而且最大光合速率达到最高; pH=7.2和9.2时,藻细胞能维持较高的生长,且对无机碳的亲和力高于pH=8.2实验组。总而言之,过高或过低的pH胁迫会引起米氏凯伦藻生理状态的不良变化,尤其当pH过低时米氏凯伦藻生理状态受到严重影响。