应用LC-MS联用方法分析青岛近海渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)细胞中的毒素成分

建立了可用于微量腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)毒素分析的高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析方法,并于2009年4月从青岛近海团岛湾采集浮游植物样品,应用所建立的LC-MS方法对手工挑取的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)细胞产毒状况进行了分析。结果显示,该方法具有良好的灵敏度和精密度,能够对30个鳍藻细胞中的毒素成分进行检测。运用该方法从渐尖鳍藻样品中检测到了大田软海绵酸(okadaic acid,OA)、鳍藻毒素1(dinophysistoxin 1,DTX1)和扇贝毒素2(pectenotoxin 2,PTX2)等毒素成分,细胞中OA,DTX1和PTX2毒素的含量分别为2.54 pg/cell,4.04 pg/cell和1.73 pg/cell,这是首次对我国近海鳍藻产毒状况的报道。     

一种可商业化生产的胶体金快速免疫层析卡:检测大田软海绵酸及其衍生物(DTX1, DTX2)

建立一种胶体金快速免疫层析检测贝类体内腹泻性贝毒主要成分软海绵酸及其衍生物鳍藻毒素的方法。合成偶联抗原OA-OVA,将适当浓度的偶联抗原和HRP标记的羊抗鼠IgG分别包被在试纸条的检测线和控制线上,胶体金标记的抗OA单克隆抗体包被金标垫,优化检测线的最佳包被浓度等条件以得到最低检出限。结果表明:该试纸条的检出限为16 ng/mL（OA,DTX1 & DTX2）,检测时间为10 min。本研究所建立的胶体金免疫层析检测贝类中大田软海绵酸及其衍生物鳍藻毒素的方法可以满足规定的160 μg/kg贝肉的安全阈值,可以应用于实际贝类样品的腹泻性贝毒的半定量检测。     

我国近海有毒微藻及其毒素的分布危害和风险评估

近年我国海域有害赤潮频发,赤潮优势种的变化显著,最近7a记录了51种引发赤潮的优势赤潮生物,其中由有毒微藻引发的赤潮增加。有毒微藻在我国海域广泛分布,至少3个株产麻痹性贝毒的亚历山大藻,5种能产生腹泻性贝毒软海绵酸毒素和鳍藻毒素、以及扇贝毒素的鳍藻在我国沿海都有分布;产生虾夷扇贝毒素的三种甲藻在北黄海常年存在。我国多种贝类中已发现麻痹性贝毒、软海绵酸毒素和鳍藻毒素、扇贝毒素、虾夷扇贝毒素和环亚胺毒素等多种微藻毒素。本文较系统的归纳综述了我国有害赤潮、优势种的变化趋势和分布特点,产生的藻毒素结构;我国双壳贝类等海洋生物中存在的微藻毒素的种类结构;首次利用风险商值法研究评估了我国贝类的健康风险。结果表明,只有春季来自福建的2个样品具有食用风险;但大连海区的贝类样品、评估值全都接近安全限值,可能表明具有某种区域性风险;在春末夏初,大窑湾的贻贝风险最大,其次是扇贝,牡蛎的风险最小;不同的贝器官,富集藻毒素的能力差别大,消化腺中的藻毒素含量远高于其它器官,不同的食用方式可能会导致不同的中毒风险。总体上,我国沿海常见种双壳贝类的麻痹性贝毒和虾夷扇贝毒素食用风险低。     

我国虾夷扇贝毒素的研究进展

虾夷扇贝毒素(yessotoxins, YTXs)是甲藻产生, 并可在滤食性生物体内累积的一类多环聚醚海洋微藻毒素。由于其经常与腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning, DSP)中的大田软海绵酸(okadaic acid, OA)和鳍藻毒素(dinophysistoxins, DTXs)共同存在, 所以YTXs最初被划分为腹泻性贝毒。研究表明YTXs并不会诱导腹泻, 也不具有抑制蛋白磷酸酶2A活性的能力, 而是对动物的心脏、肝脏、神经系统造成损伤, 所以研究人员将其从DSP组中分离出来。随着对YTXs的分子生物学研究不断深入, 科研工作者已从贝类和甲藻中分离出100多种YTX同系物, 其中仅有约40种衍生物的结构通过高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)和核磁共振技术(NMR)得到证实。YTXs毒素广泛分布于全球海域, 其潜在威胁不容忽视。本文对虾夷扇贝毒素的来源、分布、毒性以及国内研究现状等进行了综述, 以期为深入研究、制定监测规划、预防和消除其危害提供理论基础。     

赤潮毒素研究进展

近年来,赤潮是全球最严重的海洋生态灾害之一,在我国也尤为突出.本文就赤潮毒素麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、记忆缺失性贝毒、神经性贝毒,以及两加鱼毒的分布特征、产毒藻类、化学组分与结构、毒素转化、致毒机理、食用标准、检测方法等国内外研究进展,进行系统的论述,为我国的赤潮监测和灾害防治提供参考.     

辽东湾毒害微藻潜在风险分布及环境关联

以18S rDNA V4区作为目标基因,利用自行设计的真核浮游植物鉴定引物V4（F/R）,结合高通量测序技术,对辽东湾2014年四季海水中真核藻类多样性进行了检测.结果发现了辽东湾毒害藻类共29种,曾引发赤潮或褐潮的种类有19种,可导致鱼类大规模死亡的有8种,主要为甲藻门.有18种疑似为辽东湾新记录种,其中9种在中国海域未见报道;发现麻痹性贝毒（PSP）产毒藻8种,腹泻性贝毒（DSP）产毒藻2种,产虾夷扇贝毒素（YTX）产毒藻3种,神经性贝毒（NSP）产毒藻2种,溶血毒素（hemolysin）产毒藻13种,另外还有1种褐潮产毒藻（EPS）.辽东湾检出的毒害藻类中有8种自养型、1种异养型、20种混合营养型藻类.麻痹性贝毒、虾夷扇贝毒素、溶血毒素在夏季风险较高,神经性贝毒在秋季风险较高,腹泻性贝毒在春、夏季风险均较高,辽东湾东西两岸是贝毒风险高发区.辽东湾春季水温对YTX、NSP产毒藻影响显著负相关;夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd对各产毒藻类影响显著正相关;秋季各环境因子对各产毒藻类影响不显著;冬季Zn、As、Oil、DIN对各产毒藻类影响显著正相关,水温对各产毒藻类影响显著负相关,各产毒藻类与环境因子关联性有待于进一步研究.     

长江口赤潮多发区潜在有毒藻类和赤潮毒素的初步调查

通过长江口赤潮多发区2003年-2005年的有毒藻类和贝类原产地赤潮毒素的监测,初步结果表明该海域存在多种潜在有毒藻类,主要包括产麻痹性贝毒(PSP)的链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、塔玛亚历山大藻(A．tamarens),产腹泻性贝毒(DSP)的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata,)、具尾鳍藻(D．caudata)、倒卵形鳍藻(D．fortii);产记忆缺失性贝毒(ASP)的尖刺拟菱形藻(Pseudo-Nitzschia pungens)、多列拟菱形藻(P．multiseries)、柔弱拟菱形藻(P.delicatissima )和多纹拟菱形藻(P．multistriata);产神经性贝毒(NSP)的短凯伦藻(Karenia brevis),其他有毒有害藻类包括红色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)、Heterocapsa circularisquama、米氏凯伦藻(K．mikimotoi)、Chatenela marina,Heterisigma akashiwo等其他有毒藻类。有毒藻类种类5、6月份较多,产腹泻性贝毒(DSP)和产记忆缺失性贝毒(ASP)的潜在有毒藻类常年均在该海域出现,这些有毒有害藻类多数密度并不高,Heterocapsa cirularisquama曾在2003年和2005年两次形成赤潮,并导致部分养殖贻贝死亡,米氏凯伦藻于2005年5-6月在长江口海域形成大规模赤潮,并导致养殖鱼类死亡。与有毒藻类监测同步开展了赤潮毒素检测,长江口贝类赤潮毒素检出时段主要集中在5-8月份,麻痹性贝毒和腹泻性贝毒的检出率分别为5％和15％左右,敏感种类为养殖的紫贻贝。     

麻痹性贝毒研究概况

由误食染毒贝类,引起以外周神经肌肉系统麻痹为初始症状的中毒,称为麻痹性贝中毒。存在于自然界中的麻痹性贝毒是由数种双胍基嘌呤类物质组成的混合物。现已查明这类物质多于16种,它们是非结晶、高极性和不挥发的化合物。其中某些组分如石房蛤素、膝沟藻毒素的毒力极大。这种中毒常导致人的死亡。 由于麻痹性贝中毒不断在世界各地发生,定期监测水产品所含毒素的毒力已成为水产养殖,环境保护和食品卫生部门的一项迫切任务。     

福建三都湾赤潮监控区的麻痹性贝毒和腹泻性贝毒研究

运用美国分析化学家协会(AOAC)推荐的小白鼠生物测定法，对三都湾赤潮监控区的经济贝类于2003年5月．10月进行每月1次的麻痹性贝毒(PSP)和腹泻性贝毒(DSP)含量检测。结果表明：在此期间均未检测出PSP；DSP于7、8、10月在紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)体内检出，其中10月检出DSP含量为10Mu／100g，超标。     

海洋藻类毒素的生态毒理学研究

从生态毒理学角度介绍了麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(NSP)、神经性贝毒(NSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)和西加鱼毒素等几种主要海洋藻类毒素的一些研究进展,包括毒素对人类及海洋生物的毒性、毒素在食物链中的积累和转移、毒素的致毒途径、海洋生物对毒素的回避和选择性取食等。这些毒素可通过食物链在贝类或其他海洋动物体内积累并浓缩放大,从而危及人类健康,有的毒素还能直接对海洋生物产生毒害作用,破坏海洋生态环境。文中同时也介绍了该领域研究工作在我国开展情况及今后的研究方向。     

Ames试验对海产贝类遗传毒性的检测

采用Ames试验结合小白鼠生物学试验对贝类腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)的提取物进行了遗传毒性初步研究。结果表明:4份贝类样品不同程度地受到了遗传毒物的污染,7份贝类样品受到腹泻性贝毒污染。同时本文也从实践上证明在我国海洋环境监测开展Ames试验对贝类遗传毒性检测具有极为重要的意义。     

HPLC分析检测我国沿海双壳贝类体内赤潮毒素

使用HPLC方法分析了2001年8～10月间采集的我国沿海双壳贝类体中的腹泻性贝毒(DiarrheticShellfishPoisoning,DSP)。共分析了肌肉样品64个,消化腺样品11个,其中渤海18个肌肉样品中检出DSP的7个,南海和东海DSP未检出,消化腺检出DSP的有6个,含量最高的是菊花岛菲律宾蛤仔消化腺7.12×10-6(湿重)。并首次报道分析我国沿海双壳贝类体内记忆缺失性贝毒(AmnesicShellfishPoisoning,ASP)HPLC分析方法和结果。     

枝角类为媒介的麻痹性贝类毒素传递与代谢研究

为了弄清麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)在海洋生态系统中的产生、转化和归宿,本文以海洋枝角类为媒介,研究了麻痹性贝类毒素在海洋食物链中的传递与代谢过程.结果表明,PSP毒素可以沿甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)→枝角类蒙古裸腹溞(Moina mongolica)→红鳍东方纯(Fugu rubripes)鱼苗进行传递和代谢.整个实验过程中,塔玛亚历山大藻、蒙古裸腹潘、红鳍东方纯均检测到C1+2,鱼苗体内还发现似新生成的neoSTX.毒素传递过程中,C1+2中低毒性的α型毒素C1比例增大;毒素在鱼苗体内净化时,各PSP成分和总毒素含量普遍随净化时间的延长而减少.该结果为解释麻痹性贝类毒素为何在海洋各营养级生物体中广泛存在提供了直接的证据,也为我国开展麻痹性贝类毒素的监测和管理提供了新的理论依据.     

基于产毒基因sxtA的qPCR方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中的应用初探

麻痹性贝毒(paralytic shellfish toxins)包括石房蛤毒素(saxitoxin)及其同系物,是一类具有神经毒性的生物毒素,主要由甲藻和蓝藻产生。近年来,在蓝藻和甲藻中相继发现了一些与石房蛤毒素合成密切相关的基因,并建立了基于特定产毒基因的有毒藻类检测方法。长江口邻近海域是我国近海有害藻华的高发区,本研究尝试应用基于麻痹性贝毒产毒基因sxtA的qPCR检测方法,与有毒塔玛亚历山大藻复合种(I型和IV型)的qPCR检测方法和麻痹性贝毒的高效液相色谱方法相结合,对2013年春季长江口邻近海域两条断面上有毒藻和藻毒素的分布及变动情况进行了分析。结果表明,基于sxtA的qPCR检测结果与IV型塔玛亚历山大藻复合种的数量存在较好的相关性(r2=0.52,P0.05),说明IV型塔玛亚历山大藻复合种是采样期间长江口邻近海域麻痹性贝毒的主要来源;而样品中藻毒素含量与两种qPCR方法得到的有毒藻数量之间并没有明显相关性。可见,基于产毒基因的检测方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中具有一定优势,但不足以准确反映该海域藻毒素的水平。     

大窑湾海域虾夷扇贝体内麻痹性贝毒的周年变化

麻痹性贝毒是对人体健康构成严重危害的甲藻类毒素。2007～2008年,大窑湾虾夷扇贝体内麻痹性贝毒2周年的调查发现,其含量与组分有着明显的季节变化,4-7月份麻痹性贝毒含量较高,4月份最高,平均含量可达378.32μg STXeq/100 g,有C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、neoSTX、STX等10种毒素组分。大窑湾虾夷扇贝体内麻痹行贝毒组分显著增多,含量明显增高。     

大连近岸海域经济贝类麻痹性贝毒分析

对2007年1月至2008年10月间大连地区近岸海域经济贝类的麻痹性贝毒采用小鼠生物法检测,结果表明:2007年4月至9月及2008年2月至8月贝类中的麻痹性贝毒超标情况较多,超标率较高的地点是长海财神岛、庄河黑岛.在染毒的贝类种类中,主要以虾夷扇贝为主,在杂色蛤和牡蛎中未检出麻痹性贝毒.通过ELISA的方法研究了虾夷...     

浙南海域麻痹性贝毒研究

在浙南海域共采集了10种贝类40份样品.运用高效液相色谱方法检测麻痹性贝毒,共检出5份样品含有麻痹性贝毒.染毒样品检出的麻痹性贝毒毒力值范围为22.3～70.0 μgSTXeq/100 g软组织,均低于我国目前暂定的80μgSTXeq/100 g的安全警戒值.5个样品中共检测出7种麻痹性贝毒成分,其中以C2,GTX5和...     

利玛原甲藻中大田软海绵酸和鳍藻毒素-1提取与纯化

批量培养产生腹泻性贝类毒素的利玛原甲藻,甲醇提取超声破碎后的藻细胞;用大孔吸附树脂HP20富集其胞外毒素并进行毒素的初步纯化。经制备型高效液相色谱法分离,分别得到毫克级的大田软海绵酸和鳍藻毒素-1固体。经核磁共振氢谱和高分辨质谱确认结构,定量核磁确定纯度,得到的大田软海绵酸和鳍藻毒素-1纯度分别为99.39%和99.26%,满足标准物质制备要求。     

浙江近岸有害赤潮发生区麻痹性贝毒素研究

用小白鼠生物检测法和高效液相色谱法对采自浙江舟山海域和浙江中南部海域的麻痹性贝毒素进行了调查分析。结果表明:浙江舟山海域六横岛的西格织纹螺含有贝毒,其毒素含量为3.7 Mu/g,舟山海域有毒贝类检出率为3.1%。浙江中、南部海域南麂列岛的棒锥螺含有贝毒,其毒素含量<1.7 Mu/g,浙江中、南部海域有毒贝类检出率为9.1%。     

紫贻贝(Mytilus edulis)体内麻痹性贝毒室内降解研究

为了探讨麻痹性贝毒在紫贻贝(Mytilus edulis)体内的降解情况,于2009年4月中旬在大连市大窑湾海域采集640只紫贻贝在实验室条件下进行人工解毒试验。结果表明:实验第0 d时紫贻贝闭壳肌中的麻痹性贝毒以neo-STX为主,占总毒素含量的96.59%;性腺中只检测到GTX1一种组分,含量为43.17μgSTXeq/100 g;而紫贻贝的内脏团中的麻痹性贝毒含量最高,为162.68μgSTXeq/100 g,组成成分也复杂,共检出7种组分;外套膜和鳃中未检测到任何形式的麻痹性贝毒组分。在降解试验过程中,紫贻贝闭壳肌内的麻痹性贝毒的含量变化较小,但出现GTX3新组分;内脏团中的麻痹性贝毒变化较复杂,降解速度较快,实验第30 d时,仅检出一种组分neo-STX,含量为48.37μgSTXeq/100 g,共降解70.98%;而性腺中的GTX1在实验第3 d以后再未检出。