大田软海绵酸和鳍藻毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条的研制与应用

腹泻性贝类毒素主要包括大田软海绵酸（okadaic acid,OA）、鳍藻毒素-1（dinophysis toxin-1,DTX-1）和鳍藻毒素-2（dinophysis toxin-2,DTX-2）。被贝类毒素污染的海产品可对食用者的健康构成危害。在我国近岸海域OA常有检出,DTX-1和DTX-2偶有检出。本文用荧光免疫微球标记抗OA单克隆抗体,利用牛血清白蛋白合成高偶联比的包被抗原,以硝酸纤维素膜为载体,运用免疫层析技术,研制了能够同时快速准确检测OA、DTX-1和DTX-2的时间分辨荧光免疫层析试纸条,定量限分别为90.6 μg/kg、115.4 μg/kg和69.8 μg/kg。实验验证结果表明:本文研制的时间分辨荧光免疫层析试纸条对含有OA、DTX-1和DTX-2中的一种、两种或三种组分的毒素样品检测结果,与液相色谱?串联质谱法检测结果的相关性良好。该时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏、准确、操作简便,成本低,在我国海洋环境监测及海产品食用安全检测中,应用前景良好。     

应用LC-MS联用方法分析青岛近海渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)细胞中的毒素成分

建立了可用于微量腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)毒素分析的高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析方法,并于2009年4月从青岛近海团岛湾采集浮游植物样品,应用所建立的LC-MS方法对手工挑取的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)细胞产毒状况进行了分析。结果显示,该方法具有良好的灵敏度和精密度,能够对30个鳍藻细胞中的毒素成分进行检测。运用该方法从渐尖鳍藻样品中检测到了大田软海绵酸(okadaic acid,OA)、鳍藻毒素1(dinophysistoxin 1,DTX1)和扇贝毒素2(pectenotoxin 2,PTX2)等毒素成分,细胞中OA,DTX1和PTX2毒素的含量分别为2.54 pg/cell,4.04 pg/cell和1.73 pg/cell,这是首次对我国近海鳍藻产毒状况的报道。     

腹泻性贝毒的研究概况

本文介绍了日本等国家沿海地区人们食用贝类引起的腹泻性贝毒的概况。由倒卵形鳍藻和渐尖鳍藻使贻贝、海扇和扇贝等多种贝类染毒,食后产生以恶心、呕吐、腹泻和腹痛为特征的食物中毒,称为腹泻性贝毒。其毒素的主要成分为鳍藻毒素-1(DTX1),DTX1对小鼠腹腔注射的最小致死量为160μg·kg～1,对人的最小中毒量为32μg。 日本学者认为鳍藻引起的腹泻性贝毒,在日本和世界各地均有发生食物中毒的可能。     

我国近海有毒微藻及其毒素的分布危害和风险评估

近年我国海域有害赤潮频发,赤潮优势种的变化显著,最近7a记录了51种引发赤潮的优势赤潮生物,其中由有毒微藻引发的赤潮增加。有毒微藻在我国海域广泛分布,至少3个株产麻痹性贝毒的亚历山大藻,5种能产生腹泻性贝毒软海绵酸毒素和鳍藻毒素、以及扇贝毒素的鳍藻在我国沿海都有分布;产生虾夷扇贝毒素的三种甲藻在北黄海常年存在。我国多种贝类中已发现麻痹性贝毒、软海绵酸毒素和鳍藻毒素、扇贝毒素、虾夷扇贝毒素和环亚胺毒素等多种微藻毒素。本文较系统的归纳综述了我国有害赤潮、优势种的变化趋势和分布特点,产生的藻毒素结构;我国双壳贝类等海洋生物中存在的微藻毒素的种类结构;首次利用风险商值法研究评估了我国贝类的健康风险。结果表明,只有春季来自福建的2个样品具有食用风险;但大连海区的贝类样品、评估值全都接近安全限值,可能表明具有某种区域性风险;在春末夏初,大窑湾的贻贝风险最大,其次是扇贝,牡蛎的风险最小;不同的贝器官,富集藻毒素的能力差别大,消化腺中的藻毒素含量远高于其它器官,不同的食用方式可能会导致不同的中毒风险。总体上,我国沿海常见种双壳贝类的麻痹性贝毒和虾夷扇贝毒素食用风险低。     

软骨藻酸胶体金免疫层析检测试纸条的研制

制备软骨藻酸（DA）胶体金免疫层析快速检测试纸条,建立一种快速检测贝类食品中软骨藻酸含量的检测方法.采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备颗粒直径20 nm的胶体金;电镜鉴定后,确定胶体金标记软骨藻酸单克隆抗体的最佳条件并制备金标抗体;金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上制成胶体金结合垫;软骨藻酸与牛血清蛋白（BSA）的偶联物构成的包被...     

我国虾夷扇贝毒素的研究进展

虾夷扇贝毒素(yessotoxins, YTXs)是甲藻产生, 并可在滤食性生物体内累积的一类多环聚醚海洋微藻毒素。由于其经常与腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning, DSP)中的大田软海绵酸(okadaic acid, OA)和鳍藻毒素(dinophysistoxins, DTXs)共同存在, 所以YTXs最初被划分为腹泻性贝毒。研究表明YTXs并不会诱导腹泻, 也不具有抑制蛋白磷酸酶2A活性的能力, 而是对动物的心脏、肝脏、神经系统造成损伤, 所以研究人员将其从DSP组中分离出来。随着对YTXs的分子生物学研究不断深入, 科研工作者已从贝类和甲藻中分离出100多种YTX同系物, 其中仅有约40种衍生物的结构通过高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)和核磁共振技术(NMR)得到证实。YTXs毒素广泛分布于全球海域, 其潜在威胁不容忽视。本文对虾夷扇贝毒素的来源、分布、毒性以及国内研究现状等进行了综述, 以期为深入研究、制定监测规划、预防和消除其危害提供理论基础。     

利玛原甲藻中大田软海绵酸和鳍藻毒素-1提取与纯化

批量培养产生腹泻性贝类毒素的利玛原甲藻,甲醇提取超声破碎后的藻细胞;用大孔吸附树脂HP20富集其胞外毒素并进行毒素的初步纯化。经制备型高效液相色谱法分离,分别得到毫克级的大田软海绵酸和鳍藻毒素-1固体。经核磁共振氢谱和高分辨质谱确认结构,定量核磁确定纯度,得到的大田软海绵酸和鳍藻毒素-1纯度分别为99.39%和99.26%,满足标准物质制备要求。     

长江口赤潮多发区潜在有毒藻类和赤潮毒素的初步调查

通过长江口赤潮多发区2003年-2005年的有毒藻类和贝类原产地赤潮毒素的监测,初步结果表明该海域存在多种潜在有毒藻类,主要包括产麻痹性贝毒(PSP)的链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、塔玛亚历山大藻(A．tamarens),产腹泻性贝毒(DSP)的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata,)、具尾鳍藻(D．caudata)、倒卵形鳍藻(D．fortii);产记忆缺失性贝毒(ASP)的尖刺拟菱形藻(Pseudo-Nitzschia pungens)、多列拟菱形藻(P．multiseries)、柔弱拟菱形藻(P.delicatissima )和多纹拟菱形藻(P．multistriata);产神经性贝毒(NSP)的短凯伦藻(Karenia brevis),其他有毒有害藻类包括红色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)、Heterocapsa circularisquama、米氏凯伦藻(K．mikimotoi)、Chatenela marina,Heterisigma akashiwo等其他有毒藻类。有毒藻类种类5、6月份较多,产腹泻性贝毒(DSP)和产记忆缺失性贝毒(ASP)的潜在有毒藻类常年均在该海域出现,这些有毒有害藻类多数密度并不高,Heterocapsa cirularisquama曾在2003年和2005年两次形成赤潮,并导致部分养殖贻贝死亡,米氏凯伦藻于2005年5-6月在长江口海域形成大规模赤潮,并导致养殖鱼类死亡。与有毒藻类监测同步开展了赤潮毒素检测,长江口贝类赤潮毒素检出时段主要集中在5-8月份,麻痹性贝毒和腹泻性贝毒的检出率分别为5％和15％左右,敏感种类为养殖的紫贻贝。     

失去记忆性贝毒ASP酶联免疫检测方法的研究

建立了赤潮毒素失去记忆性贝毒中主要成分软骨藻酸(domoic acid,DA)的竞争酶联免疫检测方法.通过将DA偶联到蛋白载体上,免疫BALB/c小鼠,免疫数次后,得到抗DA的多克隆抗血清,以DA-OVA为包被抗原,利用抗原抗体反应,建立间接竞争酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)分析检测海水样品和海洋贝类中的赤潮毒素失去记忆性贝毒DA的方法.结果表明,该方法最低检出限10μg/L,海水样品平均回收率102.%,批内变异系数12.%;贝类样品平均回收率为111.%,批内变异系数4.8%.     

腹泻性贝类毒素大田软海绵酸液态芯片检测方法的建立

利用间接竞争法免疫学原理,以自制的大田软海绵酸(okadaic acid,OA)与卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)的偶联物OA-OVA包覆微球为载体,同时自制生物化抗OA单克隆抗体,利用液态芯片(Luminex Xmap 200TM)系统建立OA液态芯片定量检测方法;同时测定了方法的灵敏性和特异性,并对贝类模拟样本进行了测试。结果显示:液态芯片法对OA的检测线性范围为0.2～63μg/L,最低检测值为0.129μg/L,均优于酶联免疫吸附法;除与DTX-1的交叉反应率为54.2%外,与其他几种用于检测的贝类毒素没有任何交叉现象;在加标浓度为6.25～400μg/L时,回收率为84.96%～90.35%,变异系数为3.20%～6.59%。因此,该方法可满足海产品中贝类样品OA限量标准检测。     

大亚湾大鹏澳海域贝类和浮游植物中脂溶性毒素及软骨藻酸研究

本文采用液相色谱－质谱联用法（LC-MS/MS）研究了2017年4个季节大亚湾大鹏澳水体浮游植物以及葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）、紫贻贝（ Mytilus edulis）和珍珠贝（Pteria margaritifera）3种双壳贝类中脂溶性毒素的含量特征。结果显示,水体浮游植物中存在具尾鳍藻...     

抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了构建针对石油运输泄露导致的海洋环境中萘等多环芳烃污染的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文以2-萘丁酸-KLH为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株,捕获ELISA测定小鼠免疫球蛋白亚型。结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1:80000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到5个能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1:15625,抗萘单克隆抗体免疫球蛋白亚型均为IgG1,Kappa轻链。本方法成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗萘单克隆抗体,抗体亚型符合免疫学检测的特性,为萘的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析（GICA）试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源。     

广东省沿海脂溶性贝类毒素的分布特征

为了弄清广东省沿海脂溶性贝类毒素的分布特征,采用高效液相色谱-质谱联用法对2013年11月至2015年10月间采自广东省沿海5个地区（汕头南澳、汕尾、深圳大鹏澳、珠海、阳江闸坡）的贝类样品进行了脂溶性贝类毒素的检测和分析。结果表明:在所采集的43种贝类,174个样品中共检测出5类脂溶性贝毒,分别为OA、AZAs、GYM、YTXs和PTXs类,毒素含量普遍较低且均未超标。广东省沿海的脂溶性贝类毒素存在地域性、季节性和贝种间差异。在地域上,OA、AZAs和YTXs呈现明显的地域性差异,三类毒素的检出率和平均含量均以粤东的汕头南澳最高。GYM和PTXs的地域性差异不显著。在季节上,OA的检出率在秋季最高,PTXs的检出率和平均含量均以春季最高。AZAs、GYM和YTXs则无季节性差异。在同一海域,贝体中毒素的含量及检出率也因贝种的不同而存在差异。     

自组装纳米金修饰玻碳电极检测亚硝酸根

将N-［3-(三甲氧硅基)丙基］-乙二胺与金溶胶通过自组装制备亚硝酸根的电化学传感器.原子力显微镜图(AFM) 显示纳米金自组装在氨基硅烷修饰的玻碳电极表面.由于质子化的氨基硅烷与带负电的亚硝酸根间的相互作用以及纳米金对亚硝酸根具有较好的催化作用,亚硝酸根在该修饰电极上的氧化电位与在玻碳电极上的氧化电位相比负移了140 mV.利用微分脉冲伏安法和微分脉冲安培法研究了亚硝酸根电流响应信号与浓度间的关系.在最优实验条件下,亚硝酸根的氧化峰电流与其浓度在5.0×10^-7～1.0×10^-3 mol·L^-1的浓度范围内呈良好的线性关系, 检测限可达到2.0×10^-7 mol·L^-1(信噪比为3). 用分光光度法及本研究提出的方法对实际样品中亚硝酸根的测定进行了比较,测定结果的差异很小.本研究所提出的测定亚硝酸根的方法具有较高的灵敏度和较好的重现性.