城市地表水中肠道病原微生物与粪便污染指示菌的关系研究

本研究选择肠道病毒、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌作为城市水体中典型的肠道病原微生物,分别建立起相应的实时荧光定量PCR检测方法.对水源水、景观娱乐用水以及城市河流样品进行长期监测,考察典型肠道病原微生物的分布特征和变化规律.肠道病毒在各地表水体中都有检出,浓度大都在103copy·L-1以下.大肠埃希氏菌的含量在保护良好的水体和接纳城市污水的水体中有明显差别,而伤寒沙门氏菌和志贺氏菌通常出现在受粪便污染较重的水体中.统计学的分析结果显示各种水体中的肠道病原微生物检出浓度均符合对数正态分布规律.粪便污染指示菌与肠道病毒之间不存在显著的相关性,但却能在一定程度上反映典型肠道病原菌的存在情况.在大肠菌群或粪大肠菌群浓度为104CFU·L-1以上的样品中,伤寒沙门氏菌、志贺氏菌具有较高的阳性率.     

土壤环境中肠道致病菌的多重PCR检测研究初探

建立同时检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌等5种土壤常见肠道致病菌的多重PCR检测技术,为这些肠道致病菌感染的快速诊断提供实验依据.根据这些肠道病原菌的毒素基因、高度保守基因及特异性基因分别合成5对特异性引物,应用PCR扩增技术对目的菌株进行特异性检测.实验结果表明,5对寡核苷酸引物都具有较高的特异性和专一性,多重PCR检测限达到104cfu·g-1.多重PCR应用于土壤样品分析,极大的缩短了检测时间(仅需3～4h)、降低了检测成本,对控制病原菌的传播具有重要意义,可推广应用于环境监测、水源检测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域.     

Real Time PCR研究进展及其在海洋病原生物检测中的应用

Real Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,目前已广泛应用于分子生物学研究的各个领域.Real Time PCR技术秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点,同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等缺点,无需在反应结束后通过电泳操作确认扩增产物.目前,Real Time PCR可设计多对引物在同一反应体系中同时对多个靶基因进行扩增,实现多莺实时定量检测.Real Time PCR使PCR技术发生了质的飞跃,扩展了PCR技术的应用范畴,是一种具有划时代意义的技术.本文主要介绍Real Time PCR的主要原理、解析方法、技术发展趋势及其在海洋病原生物检测方面的应用.     

水传病原微生物PCR-纳米金显色快速检测方法

水传病原微生物是腹泻等肠胃疾病发病的主要原因,而发展快速、有效的检测方法对于控制和减少该类微生物的传播风险十分重要.因此,本文研究了PCR反应结合不修饰的纳米金颗粒(Gold nano-particles,AuNPs)显色检测方法的最佳盐浓度、探针含量、PCR反应条件等,并从纳米金制备、病原菌种类、检测特异性等方面进行考核,确定了最优检测条件为:10μL PCR扩增产物混合20 pmol探针,95℃反应5 min,55.5℃反应3 min后,40℃杂交10 min;此时,先后加入90μL实验用纳米金和一定浓度的PBS溶液,室温观察颜色变化.结果发现,纳米金溶液由红色变为紫色或近于无色为阳性结果,对应的吸光度值迁移出530 nm,以此可达到快速检测病原微生物的目的.     

荧光定量PCR技术在环境监测中的应用研究

实时荧光定量PCR是在PCR基础上发展起来的一种核酸定量技术,此技术灵敏度高,特异性强。目前也已被国内外应用在环境监测方面。如可以用此方法来监测环境中微生物在河流中随季节的变化情况,评价菌的富集情况,快速检测微生物等。随着此技术的不断发展,此方法在环境监测方面将会有广阔的应用前景。     

PCR及其衍生技术对水中病原体检测的研究进展

水环境中的病原体严重危害水质安全和人类健康。建立水环境中病原体的高效、快速检测方法,对预防和控制水体病原体暴发、保障水质安全具有重要意义。PCR及其衍生技术因其具有高度灵敏性、特异性和准确性等特点,成为检测水环境中病原体最常用的方法之一。该文综述了利用PCR及其衍生技术对水环境中病毒、致病菌、病原原生动物、病原蠕虫等病原体检测的研究进展。     

水环境中大肠杆菌PCR快速检测体系的研究

应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,建立能在12 h内快速检测大肠杆菌的体系.把环境水样过滤浓缩后,将截留在膜上的细菌直接或8 h增菌后提取DNA模板,以大肠杆菌Uid A基因设计引物,经过PCR扩增、凝胶电泳检测,水环境样品在不增菌条件下和增菌条件下检出限分别为1.52×104个/L,1个/L.与滤膜法比较,PCR法时间缩短、灵敏度和准确度提高,适宜于水环境中大肠杆菌的快速检测.     

九龙江下游水源水中新发病原微生物和抗生素抗性基因的定量PCR检测

新发水传病原微生物和抗生素抗性基因对于饮用水的生物安全性有重要意义.以7种典型的水传病原微生物和4种抗生素抗性基因作为检测指标,对闽西南地区的重要水源九龙江下游水源水进行了检测.从九龙江下游4个采样点和附近某水厂进出水采集水样,用0.22μm的滤膜过滤后,进行DNA提取及荧光定量PCR检测.结果表明,九龙江下游水源水中Salmonella enterica(Salmonella spp.)、Legionella pneumophila(L.pneumophila)和Pseudomonas aeruginosa(P.aeruginosa)等个别指标可达到103、104、105copies.mL-1的水平.有机物浓度可能对病原微生物和抗生素抗性基因的水平有较大影响.水厂常规工艺对于大多数病原微生物和抗生素抗性基因可以实现有效去除,但对Salmonella spp.的去除效果不理想.因此为保证饮用水安全,需要在清理污染源、提高处理工艺水平以及末端控制方面加强管理.     

鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的准确度评价及其应用

虹彩病毒对鱼类等水生动物有广泛的感染性,给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失.针对已研制成功的一种鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒,本文对反映其检测准确程度的灵敏性和特异性两个指标进行了检测,并在多个待测鱼样本中进行了试用.结果表明,该试剂盒的检测灵敏度相当于30个病毒粒子,无非特异性扩增反应,适用于多鱼种虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种检疫以及水质环境的监测.     

Quantitative Detection of Virulence Genes eaeA and rfbE of Pathogenic Escherichia coli in Municipal Wastewater by Real-Time PCR

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法.利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性.将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105 copy,rfbE基因模板量4.98 ～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系[ R2为0.997( eaeA)和1.000(rfbE)].结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL.利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显.     

Detection of Human Enteric Viruses in Freshwater from European Countries

The transmission of water-borne pathogens typically occurs by a faecal–oral route, through inhalation of aerosols, or by direct or indirect contact with contaminated water. Previous molecular-based studies have identified viral particles of zoonotic and human nature in surface waters. Contaminated water can lead to human health issues, and the development of rapid methods for the detection of pathogenic microorganisms is a valuable tool for the prevention of their spread. The aims of this work were to determine the presence and identity of representative human pathogenic enteric viruses in water samples from six European countries by quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) and to develop two quantitative PCR methods for Adenovirus 41 and Mammalian Orthoreoviruses. A 2-year survey showed that Norovirus, Mammalian Orthoreovirus and Adenoviruses were the most frequently identified enteric viruses in the sampled surface waters. Although it was not possible to establish viability and infectivity of the viruses considered, the detectable presence of pathogenic viruses may represent a potential risk for human health. The methodology developed may aid in rapid detection of these pathogens for monitoring quality of surface waters.     

入境船舶压载水潜在致病菌组成及影响因素研究

船舶压载水直接促进了地理性隔离海域之间的水体交换,可作为潜在致病菌迁移扩散的媒介。本文以采集到的25艘入境船舶的压载水样品为研究对象,采用高通量测序技术对潜在致病菌群落组成和影响因素进行了初步解析。结果表明:变形菌（Proteobacteria）、拟杆菌（Bacteroidetes）和放线菌（Actinobacteria）为压载水中的优势菌门。船舶压载水中共检出36个潜在致病菌属和19个潜在致病菌种。痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）、大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）为压载水中最普遍的潜在致病菌,检出率超过50%。置换和未置换压载水中潜在致病菌的种类数量和丰度并无显著差异。此外,压载水中的潜在致病菌与磷酸盐及大肠埃希氏杆菌呈显著正相关性,表明其可能与近岸的人类活动有关。综上所述,相关部门应当对船舶压载水加强管理,以降低潜在致病菌的入侵扩散风险。     

一体化A2/O-MBR系统中抗性基因分布及去除效果研究

选取北京市某农村一体化A²/O-MBR污水处理系统,系统研究了系统中抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes,ARGs）及病原菌在全流程各个处理单元中的分布特征,基于宏基因组学的高通量测序技术对农村生活污水进水、MBR池中污泥和出水样品中ARGs及病原菌的丰度变化及去除效果进行了系统分析.结果表明：ARGs广泛存在于污水处理系统中,共检测出包括tetracycline类、aminoglycoside类和sulfonamide类在内的19类ARGs,进水中ARGs的相对丰度远远高于其在出水中的浓度,通过污水处理系统后ARGs相对丰度下降了72.25%,而大多数的ARGs在污水处理系统并不能得到完全去除.微生物群落结构变化显示,32种潜在病原体相对丰度下降明显,但大多数病原菌也无法得到完全去除.出水中残留的ARGs和病原菌仍会对受纳水体造成一定的潜在污染风险.     

基于不同生物水平的毒性检测指标研究进展

水质安全不仅关乎生态环境的健康发展,更与人类的生存质量息息相关。对水体进行毒性检测是保障水质安全的重要手段。从生物种类出发,总结了鱼类、藻类等受试生物的特点及适用范围;综述了在不同生物学层面上毒性的表征指标,其中以细胞水平为基础的检测方法可实现快速、在线的毒性检测。并对毒性检测今后的发展方向进行了展望。     

再生水灌水水平对土壤重金属及致病菌分布的影响

为了探讨再生水不同灌水水平对土壤重金属、活性微生物和典型环境致病菌分布的影响,采用室内土柱灌水实验,研究再生水、自来水不同灌水水平对土壤重金属Cd、Pb、Cu、Zn和土壤细菌、真菌、大肠菌群、大肠埃希氏菌分布的影响.结果表明：相同灌水水平下,与自来水灌溉处理相比,再生水灌溉处理下土壤重金属含量略有提高,但仍远低于《土壤环境质量标准》[GB15618-1995]限值,因此短期再生水灌溉不会造成土壤重金属污染;再生水不同灌水水平对比分析表明,充分灌溉相比非充分灌溉提高了表层土壤Cd、Pb含量,Cu、Zn含量无明显差异.此外,相同灌水水平下,再生水灌溉相比自来水显著提高了表层土壤细菌总数和大肠菌群、大肠埃希氏菌数量,对土壤真菌总数影响不大;再生水不同灌水水平对比分析表明,充分灌溉相比非充分灌溉显著提高了表层土壤细菌和真菌总数及大肠菌群、大肠埃希氏菌数量.土壤重金属与土壤活性微生物及典型环境致病菌之间的相关性分析表明,土壤Cd、Pb、Zn含量与土壤细菌、真菌总数及大肠菌群、大肠埃希氏菌数量之间呈正相关性,推断较低含量重金属对土壤活性微生物及典型致病菌的生长繁殖存在一定程度上的刺激作用.因此,再生水灌溉促进了土壤活性微生物的繁衍,并且在一定程度上增加了土壤重金属和环境致病菌的污染风险;合理控制再生水灌水水平可以有效阻控土壤重金属和致病菌含量.     

城市尾水排海过程中微生物及主要致病菌扩散规律

城市污水处理厂产生的尾水中含有大量微生物尤其是致病菌,排海后不仅对周围人群产生危害而且对海洋生态安全构成威胁.本研究以青岛市麦岛污水处理厂为研究对象,采用高通量测序技术,研究尾水排海过程中的微生物群落结构,分析尾水中致病菌在排海过程中的动态分布及季节变化规律.结果表明,尾水微生物分布在20~27个菌门,优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),主要分布在44~65个纲,其中优势菌纲主要分布在变形菌门(Proteobacteria);尾水排海过程中的主要致病菌有55种,致病基因与癌症、心血管、免疫系统、传染性、新陈代谢、神经变性等疾病相关,其中,引起人类和动物腹泻、菌血症相关的弓形杆菌属(Arcobacter spp.)、引发院内感染的条件致病菌不动杆菌属(Acinetobacter spp.)及对海产品养殖和捕捞带来威胁的Shewanella hafniensis等占比例较大.     

水质监测中的快速传感技术

传感器的发展是水质监测中的关键技术之一。以水质调查对监测技术的需求和相应传感器的发展趋势的分析为出发点,重点介绍了光纤传感器和生物传感器的原理和在水质监测中的应用,指出了快速传感技术应用的重要意义和发展前景。     

城市河流异养菌耐药状况及微生物群落结构特征

为深入了解城市河流中细菌的耐药状况和微生物群落结构特征,在西安市浐河和灞河河段8个采样点以及某污水处理厂二级出水排放口采集水样,利用细菌培养技术、PCR检测和DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析技术,对河流中异养菌耐药率、四环素抗性基因以及微生物群落结构进行研究. 结果表明:浐河和灞河水样中异养菌对SMZ(磺胺甲恶唑)、TET(四环素)、CIP(环丙沙星)和CTX(头孢噻肟)的平均耐药率分别为18.3%、6.2%、2.7%和1.3%,耐药率高低顺序与污水厂排放水中的异养菌相同. 城市河流中异养菌浓度与其耐药率并不存在显著的相关性. 与上游河段相比,污水厂排放口下游河段的异养菌浓度没有明显增加,但对多种抗生素的耐药率却有所升高. 浐河和灞河中四环素抗性基因主要是tetA和tetB,检出率分别为100%和75%,这意味着城市河流中异养菌对TET的耐药性可能主要通过编码外输泵蛋白的抗性机制来实现. 污水厂排放水进入城市河流,并未显著影响河流中的微生物群落结构,但却使某些原有的敏感物种消失,而病原菌或条件致病菌在邻近污水厂排放口的下游河段则有所增加.      

不同排海方式城市尾水微生物扩散规律

尾水中含有大量病原菌,回用或排入自然水体后会对人群健康和生态安全构成威胁.为了探究不同排海方式对微生物扩散规律的影响,本研究利用高通量测序技术对春季污水处理厂尾水细菌群落结构、优势菌群、典型致病菌及其随扩散距离的变化进行研究.结果发现,先排河后排海的尾水物种更加丰富,分布在58个菌纲,相对丰度大于1%的细菌有32种,而直接排海的尾水中仅有41个菌纲,相对丰度大于1%的细菌有28种.相对于直排过程,间排方式微生物群落结构相对丰度更高,说明尾水的直接排海使得微生物更易扩散.同一污水处理厂优势菌门所占比例随着扩散距离的增大整体呈下降趋势,蓝藻菌门(Cyanobacteria)等由于在自然水体中的高浓度出现随扩散距离增大整体上升的趋势.两个系统的优势菌门都属于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)及厚壁菌门(Firmicutes),纲、种水平重合度较低,但整体来讲排污口附近微生物多样性及丰度远高于海水(空白样品),且污水处理相关菌种丰度较高.另外,尾水中存在一定量的致病菌和条件致病菌,其中Pseudoalteromonas haloplanktis、Pseudomonas anguilliseptica致病性极强,扩散后相对丰度仍然很高,且弓形杆菌属(Arcobacter spp.)与人类和动物的腹泻、菌血症等疾病密切相关.因此,尾水排放过程中应对这几种细菌重点监测.     

水中大肠菌群检测方法研究进展

本文报道了近年来检测水质中总大肠菌群及埃希氏大肠杆菌的方法学研究进展。按其作用原理可概括为3类。第1类是通过对培养基成份及培养条件的改进达到检测目的;第2类是用酶底物0NP G和MUG与细菌产生的半乳糖苷酶及葡萄糖苷酸酶起反应,根据色泽及荧光的显示以证实总大肠菌群及埃希氏大肠杆菌的存在;第3类是采用“聚合酶链反应——基因探针”方法,根据DNA分子杂交试验以检测水样中的总大肠菌群及埃希氏大肠杆菌。其中,酶学方法较敏感,色泽及荧光显示明确,操作方便,能较快获得结果,比其他2类方法具有较多优点。