实时定量RT-PCR方法评价壬基酚的雌激素效应

壬基酚是1种环境雌激素物质,以血清卵黄蛋白原作为生物标记物检测壬基酚的最低雌激素效应浓度高于10μg/L.利用亚成体青鱼进行不同浓度的(1、10、50、100μg/L)壬基酚暴露实验,运用实时定量RT-PCR方法,从分子水平上,对青鱼VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H和CHG-L的基因表达进行了研究,并对低浓度壬基酚的环境雌激素效应进行了分析.结果表明:1μg/L浓度的壬基酚暴露组青鱼肝脏的VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L基因表达均被显著诱导,说明实时定量RT-PCR能够检测1μg/L壬基酚     

定量RT-PCR检测雌二醇诱导的青鳉鱼基因表达

采用实时定量RT-PCR(Q-RT-PCR)方法,对暴露60d雌二醇的雄性青鳉鱼肝脏内卵黄蛋白原(VTG)和卵壳前体蛋白(CHG)基因表达进行研究.结果表明,0.1,1.0,10.0,100.0ng/L的雌二醇使肝脏内VTG-I,VTG-II,CHG-L和CHG-H基因表达被显著诱导.其中VTG-I显示出较好的剂量—效应关系,是较为理想的生物标记物基因.在0.1ng/L雌二醇暴露组中,VTG-I和VTG-II的表达量均显著高于对照组(P<0.05),表明本方法具有检测环境中低剂量雌二醇暴露的潜力.     

青鳉鱼ERRα的克隆、序列分析、组织表达及其对不同EDCs暴露的响应

内分泌干扰物质(EDCs)可以通过多种通道影响鱼类的生长、发育和繁殖,而雌激素相关受体(ERR)是一类目前没有引起足够重视的潜在致毒信号通道.本研究克隆了青鳉鱼(Oryzias latipes)ERRα mRNA全序列,并通过实时定量RT-PCR方法对其在不同组织中的表达和不同EDCs暴露下的响应进行了分析.发现青鳉鱼ERRα与其它脊椎动物ERRα氨基酸序列有较高的同源性,特别是DNA结合结构域(DBD)在从鱼类到哺乳类动物的进化过程中高度保守,配体结合结构域(LBD)序列与哺乳动物的LBD有66.4%～67.0%的序列相同.青鳉鱼ERRα与青鳉鱼雌激素受体ERα、ERβ和雄激素受体ARα、Aβ的DBD氨基酸数相同,且有较高序列相似性,但LBD的长度和序列差异较大.青鳉鱼ERRα基因有5个外显子组成,位于第14号染色体.青鳉鱼ERRα基因在各组织中广泛表达,其中在性腺、脑、脾脏、眼和肠中表达较高,且在雌雄性腺中差异表达,表明其在雌雄性别分化和性腺发育中发挥调控作用.暴露200 ng/L炔雌醇(EE2)、200 ng/L雌酮(E1)、200 ng/L己烯雌酚(DES)、100 μg/L阿特拉津(AT)和200 ng/L二醇(E2)后,青鳉鱼精巢中ERRα mRNA水平分别显著下降至对照组的0.54、0.56、0.61、0.63和0.65倍(P<0.05),但暴露1 μg/L三丁基锡和1μg/L:"苯基锡后上升至对照组的1.34和1.35倍(P>0.05),表明ERRα可能参与外源EDCs影响鱼类性别分化和性腺发育的过程.此外,在青鳉鱼ERRα基因上游没有发现类似哺乳动物ERRα基因上游的类固醇激素反应元件半位点,说明鱼类ERRα基因的调控模式与哺乳类存在差异.     

MEHP对胚胎期海水青鳉(Oryzias melastigma)的内分泌干扰效应

为探讨邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯（MEHP）对海水青鳉胚胎的内分泌干扰效应,本研究调查了海水青鳉胚胎受精后暴露于MEHP（0.01,0.1,和1 mg/L）直至胚胎发育晚期-受精后10 d（10 dpf）,采用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析MEHP对内分泌干扰标志通路雌激素受体（ER）、过氧化物增殖激活受体（PPAR）通路和芳香化酶（CYP19）基因的影响。结果显示:MEHP对海水青鳉胚胎存活和孵化没有显著影响,而各MEHP处理组显著诱导了编码雌激素受体（ERα）和PPAR受体（PPARα和PPARγ）的基因表达水平,0.01和1 mg/L MEHP显著诱导了雌激素受体（ERγ）基因表达水平。MEHP暴露显著增加卵黄蛋白原（VTG）两个亚型-VTG1、VTG2,卵壳前体蛋白（Choriogenin,Chg）两个亚型-ChgH、ChgL,芳香化酶（CYP19）-CYP19a、CYP19b的基因表达水平。然而,MEHP暴露对海水青鳉胚胎编码雄激素受体的基因雄激素受体α亚型（androgen receptor α,ARα）的表达水平无显著影响。说明MEHP可通过上调芳香化酶CYP19的表达增加雄激素向雌激素的转化,增加的雌激素通过血液循环扩散进入靶组织和细胞结合雌激素受体ERs,导致ERs的上调（ERα和ERγ）,使得雌激素受体激活、二聚化并结合大多数雌激素响应基因如VTG和Chg的雌激素响应元素（EREs）,增加雌激素响应基因VTG和Chg的表达,增加VTG和Chg的合成从而产生内分泌干扰效应。     

稀有鮈鲫和日本青鳉肝细胞原代培养及其对2,3,7,8-TCDD的敏感性比较

利用胰酶消化和机械分散相结合的方法对稀有鮈鲫和日本青鳉的肝细胞进行分离和培养,测定了不同培养时间下两种原代培养肝细胞的活力,研究了两种原代培养肝细胞受到2,3,7,8-TCDD暴露后EROD活力变化的时间-和浓度-效应关系.结果表明,稀有鮈鲫和日本青鳉的肝细胞产率分别达到2.0×107cells.g-1和1.5×107cells.g-1,稀有鮈鲫原代肝细胞的活力可以稳定地保持5d,日本青鳉原代肝细胞的活力至少可以稳定地保持1周;不同浓度TCDD暴露后,两种鱼的原代肝细胞EROD活力变化均显示良好的时间-浓度-效应关系,TCDD诱导稀有鮈鲫和日本青鳉原代肝细胞EROD活力的最低可观察效应浓度(LOEC)分别为4pg.mL-1和1pg.mL-1;TCDD诱导日本青鳉原代肝细胞EROD活力的EC50值低于稀有鮈鲫.就原代肝细胞培养操作和对毒物胁迫的敏感性而言,日本青鳉优于稀有鮈鲫.     

梭鱼和青鳉鱼ERα介导的雌激素活性比较研究

为从物种雌激素受体(ERα)敏感性差异的角度探索辽东湾野生梭鱼雌雄同体高发生率的一个可能原因,从梭鱼肝脏cDNA中扩增出长1113 bp的梭鱼ERα(sERα) DEF区片段,并以此构建pGBT9-sERα DEF 质粒,将其和pGAD424-TIF2质粒依次转入Y190酵母细胞中,建立了sERα物种特异性的酵母双杂交筛选系统.在此系统中测试了4种环境中主要的雌激素雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)及17α-炔雌醇(EE2)对梭鱼ERα的诱导活性,半数雌激素活性浓度(EC50)为3.7、2.4、1698.7、1.2nmol/L,分别是青鳉鱼ERα活性的4.6、2.3、3.4、3.3倍,说明梭鱼ERα对E1、E2、E3、EE2具有较高的敏感性,这为解释辽东湾梭鱼雌雄同体的高发生现象提供了重要线索.     

草甘膦对青鳉鱼卵黄蛋白原的诱导及其潜在分子机理

为了研究草甘膦潜在的雌激素效应,将1~3d的雌雄青鳉幼鱼暴露于不同浓度 (0.2, 2, 20, 200, 2000μg/L)的草甘膦5周,发现雌雄鱼肝脏卵黄蛋白原(VTG I)基因表达分别在0.2, 2, 20μg/L浓度(雌鱼)和2, 20, 200μg/L浓度(雄鱼)下受到显著诱导,但在高浓度下(雌鱼,200μg/L和2000μg/L;雄鱼,2000μg/L)恢复到正常水平.草甘膦诱导雌激素效应的机理存在雌雄差异:雌鱼中雌激素效应主要由于草甘膦诱导了脑部FSH和性腺CYP19A基因,从而增加了雌激素合成能力.雄鱼中主要由于草甘膦抑制肝脏中雌激素代谢酶 (CYP1A、CYP1B和CYP3A)而显示雌激素效应.     

某污水处理厂中17α-乙炔基雌二醇降解菌的分离鉴定及其降解特性

由北京某污水处理厂活性污泥中分离出以17α-乙炔基雌二醇(EE2)为唯一碳源生长的单一菌株,经16SrRNA基因序列分析鉴定为香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis),命名为SS-2菌株.研究表明,SS-2菌株在7d内对初始浓度为4mg·L-1EE2的降解率为93.6%,对初始浓度为2mg·L-1雌酮(E1)、或17β-雌二醇(E2)的降解率为99%,对雌三醇(E3)没有降解能力.SS-2菌株降解雌激素的反应符合动力学一级反应定律,其降解速率常数分别为0.236h-1(E1)、0.221h-1(E2)和0.013h-1(EE2).SS-2菌株降解E2的过程中,检测到E1的生成,并且生成的E1亦可被SS-2菌株降解;该降解过程中类雌激素活性随着E2与E1浓度的降低而显著减少,表明SS-2菌株不仅可以降解E2与E1,而且可以降低降解过程中的类雌激素活性;反应进行240h后,仍表现出少量类雌激素活性,推测是因残留的E2或E1所致,表明尚且未知的中间产物或生成物的类雌激素活性远低于E2与E1.     

利用唐鱼雌激素受体构建环境雌激素重组酵母测评系统的研究

利用唐鱼雌激素受体基因片段构建重组酵母,用以筛选环境雌激素类化学物质.实验先将唐鱼雌激素受体terα基因片段插入载体pGADT7中构建表达质粒p GADT7/TERα,同时将雌激素效应元件(ere)片段插入pMP206载体中构建报告质粒pMP206/ERE-Lac Z;然后把表达质粒和报告质粒共转化到酵母AH109中,经筛选成功构建了由唐鱼雌激素受体调控的表达lac Z基因的重组酵母AHpTERα/ERE.结果表明,所构建的重组酵母AHpTERα/ERE在不同浓度17β-雌二醇(E2)的诱导下,β-半乳糖苷酶的活性呈现出明显的剂量-效应关系,其EC50为(0.521±0.700)nmol·L-1.与DMSO对照组相比,重组酵母在17β-雌二醇诱导下有明显的β-半乳糖苷酶活性增强的现象.在不同浓度17α-乙炔基雌二醇(EE2)、壬基酚(NP)及其混合物、双酚A(BPA)、17β-雌二醇(E2)(阳性对照)的诱导下,重组酵母均呈现出剂量-效应关系,且灵敏度大小为E2EE2NPBPA.结果表明,本研究成功构建了重组基因酵母测评系统,初步判定该重组酵母可应用于环境雌激素的筛选.     

《中国环境科学》刊发的论文获“马塔切纳青年优秀论文奖”

经中国环境科学学会推荐,《中国环境科学》2006年第5期发表的侯彦峰等人的文章"定量RT-PCR检测雌二醇诱导的青鳉鱼基因表达",2007年第5期发表的程书波等人的文章"上海市地表灰尘中PAHs的来源辨析"及     

四种环境雌激素对斑马鱼内脏团抗氧化防御系统的影响研究——17B-雌二醇与三种增塑剂DMP、DBP、DOP的影响

以斑马鱼(Danio rerio)为受试动物,研究了四种环境雌激素-17β-雌二醇(E2)和三种增塑剂(DMP、DBP、DOP)对其内脏团的氧化损伤及应激效应。经急性毒性实验,得到E2、DMP、DBP、DOP对成体斑马鱼96 h的半数致死浓度(LC50)分别为2.51、12.33、9.67、9.89 mg·L-1。在此基础上分别设置5个浓度梯度,研究E2(暴露2 d,4 d)、DMP、DBP、DOP(暴露4 d)对斑马鱼内脏团的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性以及丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,SOD、CAT、GST、MDA对这四种环境激素都非常敏感,其中SOD、CAT、GST活性的影响均呈现先诱导后抑制的趋势,而MDA含量则随着污染物浓度的升高而增加。高浓度暴露条件下,E2(0.4 mg·L-1)和DMP、DBP、DOP(0.8 mg·L-1)对SOD、CAT、GST活性均有显著抑制(p0.05),MDA的含量有显著升高(p0.05)。可见,E2、DMP、DBP、DOP会导致斑马鱼内脏团氧化损伤,并且在同等浓度下E2的毒性明显高于三种增塑剂。     

苯并芘对稀有鮈鲫的内分泌干扰效应研究

为评价典型有机污染物对长江三峡库区上游特有珍稀鱼类的环境风险,本实验以稀有鮈鲫为对象,研究了低剂量多环芳烃(PAHs)暴露而引起的内分泌干扰效应.将成年稀有鮈鲫暴露于不同浓度(0、0.1、0.3、1.0和3.0μg·L-1)的苯并芘(Ba P)中28 d,测定了体质系数、性激素含量、下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴和肝脏中与繁殖相关基因的表达.结果显示:在雌鱼中,Ba P暴露后,睾酮(T)的含量显著升高,雌二醇(E2)的水平显著下降并改变了T/E2的比值;在雄鱼中,T和E2的含量都显著下降.雌雄鱼性激素的改变可能与类固醇合成相关基因(Cyp17、Cyp19a)表达量的改变有关.Ba P暴露显著抑制了雌雄鱼肝脏中卵黄蛋白原(VTG)基因的表达.以上检测到的激素或者基因表达的改变主要发生在高剂量(3.0μg·L-1)Ba P暴露下,而长江上游库区水体中多环芳烃含量较低(100 ng·L-1),因此推测,库区存在的多环芳烃不会对三峡库区上游水体中的鱼类产生内分泌干扰效应.     

布洛芬对黄颡鱼I相代谢酶及其抗氧化系统的影响

使用环境相关浓度水平(0.05、0.5、5、50 μg· L-1)的布洛芬(Ibuprofen,IBU)对黄颡鱼进行水体暴露,研究IBU对黄颡鱼Ⅰ相代谢酶及其抗氧化系统的影响.结果表明,随着暴露时间的延长,IBU对黄颡鱼肝脏Ⅰ相代谢P450酶系的氨基比林-N-脱甲基酶(APND)、红霉素-N-脱甲基酶(ERND)、7-乙氧基-异吩噁唑酮-脱乙基酶(EROD)和Ⅱ相代谢谷胱甘肽硫转移酶(GST)均表现出先诱导后抑制的作用.暴露24 h时,IBU浓度为5 μg· L-1实验组对Ⅰ相代谢酶APND和ERND的诱导程度最大.当暴露时间达到168 h时,0.5 μg·L-1浓度组中APND和ERND活性均受到极显著抑制.Ⅰ相代谢酶EROD活性在暴露24 h后,除0.05 μg· L-1浓度组无明显变化外,其它浓度组皆受到显著诱导,随着暴露时间延长到168 h时,逐渐恢复到初始水平.GST活性在暴露24 h后,除0.05 μg·L-1浓度组外,其它浓度组均受到最大程度的诱导,过氧化氢酶(CAT)在暴露168 h时被显著诱导.各浓度组丙二醛(MDA)含量在暴露24 h时较对照组显著下降,72 h时其含量达到最高值.其中,ERND响应较为敏感,适合作为布洛芬暴露的生物标记物.     

2种有机磷农药联合胁迫下日本青鳉的逐级行为响应

采用水质安全在线生物预警系统(BEWs)记录行为强度数据,探讨了2种有机磷农药敌百虫和对硫磷联合胁迫下,不同暴露浓度、不同暴露时间日本青鳉的行为响应.在不同浓度比例的农药暴露中,20、10、5、1和0.1TU的暴露浓度下行为反应时间分别为:1.4、4.8、6.4、32.2和43.0h,并且每个浓度不同配比之间行为反应时间差异不明显.结果表明,在2种有机磷农药的暴露下,日本青鳉的逐级行为响应既受化合物浓度高低的影响,又受暴露时间的影响,但每个浓度的不同配比之间的行为响应时间差异不明显,而且每个浓度2种药物不同配比暴露下的青鳉鱼的逐级行为响应基本一致,即2种作用机制相似的有机磷农药对日本青鳉的行为毒性是简单的相加作用.     

4种环境雌激素对淡水鱼卵黄蛋白原诱导的混合物效应研究

在个体水平上阐明环境雌激素类化合物对易受影响生物的联合毒性作用,探讨混合污染物联合作用和环境风险评价的研究方法.通过对鲫鱼血清卵黄蛋白原含量的相对变化和暴露浓度的非线性回归分析得出17α-乙炔基雌二醇(EE2)、17β-雌二醇(E2)、双酚A(BPA)、辛基苯酚(OP)及其等毒性混合物产生雌激素效应的剂量-反应关系,应用联合作用指数和相加作用模型研究4种环境雌激素的联合作用.各化合物非线性回归分析结果均以Weibull函数拟合效果最好,决定系数R2≥0.92;效应浓度值及其95%置信限通过自举抽样法得出,其中半效应浓度值EC50及其95%置信区间分别为0.0079(0.0068～0.0100)、0.0987(0.0900～0.1110)、63.50(56.58～70.62)和250.59(228.46～271.99)μg·L-1.4种环境雌激素混合物效应通过相加作用模型预测在全剂量范围内与实验结果相一致,呈现相似联合作用.相加作用模型是在各个浓度反应水平上展示化合物联合作用的性质,是切实可行的联合作用研究方法,而混合物效应通过联合作用指数评价存在许多不确定性.     

五氯酚对稀有鮈鲫卵黄蛋白原及p53的诱导效应

采用中国特有鱼种稀有鮈鲫为实验动物,研究五氯酚（PCP）对其肝脏卵黄蛋白原（VTG）、VTG基因及抑癌基因p53的诱导效应,评价PCP的内分泌干扰作用,并从蛋白和基因表达水平上筛选PCP检测的敏感生物标志物.1.5、15、40、80、120、150、160μg.L-1PCP暴露稀有鮈鲫,同时设置空白、溶剂对照和17α-雌二醇（EE2）阳性对照,运用SDS-PAGE,ELISA法检测经PCP暴露后稀有鮈鲫肝脏VTG蛋白的表达差异;克隆稀有鮈鲫新的VTG和p53基因序列片段,运用实时荧光定量PCR方法检测PCP暴露对基因表达的影响.结果表明,40、80、120、160μg.L-1PCP均能诱导雌雄稀有鮈鲫肝脏VTG蛋白的表达,具有显著的浓度-效应关系;1.5、15、150μg.L-1PCP暴露后,雄性稀有鮈鲫肝脏VTG和p53基因表达均明显升高,具有显著的浓度-效应和时间-效应关系.证明PCP具有雌激素效应,稀有鮈鲫肝脏的VTG蛋白、VTG及p53基因可作为PCP检测的敏感分子生物标志物.     

北方城市污水再生处理工艺出水中青鳉鱼胚胎毒性变化研究

为了考察城市污水再生处理系统进水的生态安全性,采用青鳉鱼胚胎暴露的试验方法对北方两个重要城市(北京和天津)的7个城市污水再生处理系统的进水进行了研究.结果表明,7个再生水处理系统的进水对青鳉鱼的早期发育都表现出不同程度的不利影响,其中,X、B、D 3个再生水处理系统的进水毒性最大,青鳉鱼胚胎的总致死率均达到100%.J...     

鱼毒性微藻小定鞭藻对海洋青鳉鱼的急性致毒效应研究

小定鞭藻(Prymnesium parvum)藻华通常会使养殖的鱼类大量死亡,是一种常见的鱼毒性藻类。本文以海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma)为受试生物,研究小定鞭藻胁迫对海洋青鳉鱼的急性毒性效应及抗氧化酶活性变化,以期揭示小定鞭藻对鱼类的安全阈值及致毒作用方式。研究结果表明,在浓度0.9×108~11.2×108/L范围内,随着小定鞭藻浓度的增加,其对海洋青鳉鱼的毒性越强,呈明显的剂量-效应关系。3、24、和48 h的半致死浓度LC₅₀分别为5.62×108、1.58×108和1.44×108/L。当小定鞭藻浓度分别为1.87×108和2.8×108/L时,半致死时间LT₅₀分别为41.75 h和6.5 h,最大无作用浓度为0.9×108/L,推测小定鞭藻藻华对鱼类的安全阈值为9×106/L。低浓度小定鞭藻胁迫可使海洋青鳉鱼的过氧化物歧化酶(SOD)活性降低,但不呈剂量-效应关系,高浓度小定鞭藻可诱导过氧化氢酶(CAT)活性升高,低浓度小定鞭藻可使海洋青鳉鱼丙二醛(MDA)含量升高,提示低浓度小定鞭藻胁迫可导致海洋青鳉鱼脂质过氧化,这可能是小定鞭藻对鱼类致毒作用的方式之一。     

再生水无计划间接补充饮用水的雌激素健康风险

以城市污水为水源的再生水中含有一定量的雌激素类内分泌干扰物,其在无计划间接补充饮用水过程中存在潜在健康风险.针对再生水经河流补给湖库型水源地的典型场景,研究了再生水中雌酮、雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、双酚A、壬基酚和辛基酚在水体中的变化规律,评价了雌激素的健康风险.结果表明,再生水(二级出水)中雌激素类物质的质量浓度多分布在0.1~100 ng·L-1水平;双酚A和壬基酚的浓度较高,可达到1~10μg·L-1水平.再生水间接补充饮用水过程中,雌激素的浓度受到上游来水稀释、河道湖库自然降解和饮用水处理工艺去除等作用的影响.雌酮、雌二醇、双酚A、壬基酚和辛基酚的非致癌风险较小,都低于规定值1.当湖库型水源地的水力停留时间大于30 d时,再生水中17α-乙炔基雌二醇对人体的非致癌风险值大多小于1;当停留时间小于10 d且再生水占饮用水比例达50%以上时,16%~47%样品的17α-乙炔基雌二醇的非致癌风险值大于1,其健康风险需优先关注.     

低剂量双酚A与17β雌二醇对MCF-7细胞增殖作用的剂量效应关系及其联合作用探索

采用MCF-7细胞增殖实验研究了类雌激素双酚A(BPA)、17β雌二醇(E2)对MCF-7细胞增殖效应的单独作用以及两者间联合作用的剂量效应关系.结果显示,BPA在10-10～10-3mol·L-1浓度范围内、E2在10-14～10-3mol·L-1浓度范围内的单独作用均存在低浓度促进、高浓度抑制的倒U型剂量效应关系曲线,体系中E2浓度分别为10-8、10-11、10-14mol·L-1情况下,BPA在10-3～10-9mol·L-1浓度范围内和E2的联合作用与其单独作用存在显著差异,呈现出独立作用模式.