石油降解菌株G5 16S rDNA全序列的系统学分析

用PCR方法扩增了一株石油降解菌株G5的16S rRNA基因全序列，并对其进行了克隆和测序．对该序列在GenBank中的BLAST结果表明，所有与该序列高度同源的序列都是假单胞菌的16S rRNA基因．其中假单胞菌的代表菌株Pseudomonas aeruginosa，P．fluoroscens，P .putida，P.syringae的16S rRNA基因序列与G5的16S rRNA基因序列同源性分别为93．4％，98．4％，96．3％，97．5％．对G5和其他39株假单胞菌的16S rRNA基因序列进行聚类分析，获得的系统发育树与RDP(Ribosomal Database Project)报道的系统发育树基本一致，其中菌株G5与5株P．chlororaphis聚类在一起．图2参7     

紫花苜蓿根际氢氧化细菌的分离与鉴定

利用气体循环培养体系从陕西乾县HUP-豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa)根际土壤中分离获得37株细菌.菌株氧化氢能力测定结果表明,8株菌氧化氢和自养生长能力较强,初步确定为氢氧化细菌类群;根据其形态特征、培养特征和生理生化特性,鉴定为7个不同属:假单胞菌属(Pseudomonas)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、脂肪杆菌属(Pimelobacter)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、地杆菌属(Terrabacter)和稀有杆菌属(Rarobacter);其中氧化氢能力最强的优势菌株WMQ-7 16S rDNA序列(GenBank登录号为EU807744)长度为1 451bp,GC含量为53.8%,其核苷酸序列与假单胞菌属同源性高于99%,在系统发育树上位于同一分支,将WMQ-7菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas).图2表5参16     

不同生境产脂肪酶菌株的筛选及多样性

为发掘不同特性脂肪酶微生物资源,采用纯培养方法从青海高寒草地、雅安山区、成都平原分离得到产脂肪酶菌株54株.通过对菌株的DNA进行ERIC-PCR指纹图谱分析,按聚类树划分为5个操作分类单元.16S rDNA序列测定和聚类分析显示,分离菌株分布于芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacter).多样性分析表明,与青海高寒草地、雅安山区相比,成都平原产脂肪酶菌株遗传多样性更为丰富.在54株菌中都出现了300 bp和1 300 bp两个特异且稳定出现的条带,这两个特异条带可能是产脂肪酶菌株的SCAR标记条带.     

假单胞菌反式氯双烯内酯异构酶基因克隆和序列分析

从土壤中分离得到一株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株GT241-1,从该菌株中克隆出参与降解2,4-二氯酚的反式氯双烯内酯异构酶基因(dcpE).克隆策略是采用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子.经序列测定得知,dcpE基因编码区1062bp.核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明,dcpE与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.图5表1参12     

一株聚丁二酸丁二醇酯降解菌的分离鉴定

以聚丁二酸丁二醇酯（PBS）为唯一碳源,通过滤纸片法对西安郊区土壤中可有效降解PBS聚合物的微生物进行分离,并成功获得一株降解效果最为明显的细菌菌株,其在30 d内可使PBS聚合物的数均分子量降低19.80%。采用生理生化实验以及16S rDNA序列对比分析对该菌株进行了鉴定。结果表明,该菌株的生理生化特征与铜绿假单胞菌属相似,且其16SrDNA序列与Pseudomonas aeruginosa 39016 contig 00492的核苷酸序列同源性达99%,结合生理、生化指标鉴定结果,进一步确定该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudanonas aeruginosa）。该菌株的分离鉴定为进一步研究PBS聚合物的生物降解特性及机理等奠定了基础。     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因设计了上下游引物P1和P2,通过对铜绿假单胞菌菌株X3绿色荧光蛋白标记研究,构建了铜绿假单胞菌标记系统,获得带有EGFP标记的基因工程菌X9,为进行相关的跟踪研究创造了条件.该菌株绿色荧光标记性能稳定.通过转化子基因组DNAPCR和斑点杂交检测,外源EGFP基因存在于转化子染色体上. 图 6参 14     

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)工程菌株田间残留和扩散的追踪检测

分别在北京和江苏省连云港市对携带Btcry基因的荧光假单胞菌工程菌进行了田间残留与扩散的追踪检测 .对越冬前后的试验地和保护地土壤样品进行抗生素抗性平板分离 ,能检测到极少量的具有与出发菌株相同抗性的荧光假单胞菌菌落 ,但没有发现工程菌株的残留与扩散 .对江苏试验地样品还进行了工程菌株质粒卡那霉素和壮观霉素抗性标记基因的抗性菌落分离 ,绝大多数样品中都能分离到包括荧光假单胞菌在内的抗性菌落 ,土样中菌密度n(cfu) =10 4 ～ 10 5g-1,但进行Btcry基因PCR -RFLP检测时没有从样品中得到特异扩增产物 .研究结果表明 :工程菌株抗性标记基因在自然界广泛存在 ,工程菌在株环境中没有残留和扩散 ,具有良好的生物安全性 .表 4参 8     

硝基苯降解菌的分离鉴定及降解特性

从化工厂污水处理池污泥中分离到一株能高效降解硝基苯的菌株XY-1,通过形态观察、生理生化特征和16SrDNA序列同源性分析,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).该菌株能以硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长,硝基苯初始浓度为200 mg/L时,20 h降解率可达97%.该菌在温度25～35℃、pH 7.0～9.0范围内均能高效降解硝基苯,并且对对氯硝基苯、对氯苯胺也有良好的降解效果.测序分析表明,克隆到了该菌中的硝基苯还原酶基因,推测该菌的降解途径是硝基苯部分还原途径.图6参19     

耐盐异养硝化菌驯化方法及分离菌株鉴定

采用高C/N、逐渐降低DO、菌体对数生长期前期转接以及增加培养液中海水比例的方法完成了耐盐异养硝化菌的富集和驯化,并从中分离筛选出两株高效异养硝化菌qy37和gs2.通过对两株菌的形态观察、生理生化试验以及16S rRNA序列分析,确定菌株qy37和菌株gs2分别为假单胞菌属(Pseudomonas)和盐单胞菌属(Halomonas).     

土壤甲胺磷抗性细菌种群特征脂肪酸生物标记的分析（Characteristics of PLFA Biomarkers for Acephatemet Resistant Bacteria Isolated from the Soils）

应用高浓度甲胺磷培养基,对农药厂排污口土壤微生物进行分离,鉴定出21株细菌,分属13个细菌属.对甲胺磷抗性细菌脂肪酸的分析,共测定到38个脂肪酸生物标记(PLFA),这些生物标记分为4种类型,即1)高频次分布的生物标记,普遍存在于细菌类群,属于细菌总体类群(Bacteriaingeneral)的生物标记;2)中频次分布的生物标记,在细菌种出现概率中等,可以用于代表细菌属类群(Bacteriumgenus)识别生物标记;3)低频次分布的生物标记,在细菌中的分布概率较小,可以用于指示特定细菌种间差异的生物标记;4)微频次分布的生物标记,这种生物标记仅在一种细菌种类出现,是细菌种特征生物标记.利用脂肪酸生物标记分析同属细菌不同种的差异,可将假单胞杆菌属分为2类,第1类包括了铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌,其特征为17:0CYCLO生物标记含量小于3.60%;第2类包含了伞菌假单胞菌、威隆假单胞菌、恶臭假单胞菌、温哥华假单胞菌,其特征为17:0CYCLO生物标记含量大于5.99%.利用脂肪酸生物标记的差异对甲胺磷抗性细菌种的聚类分析,能有效地将细菌类群分为3类,微生物群落中存在着稳定的生物标记和受环境影响的生物标记,论文提供了一种脂肪酸生物标记的分析方法,结合细菌的生物学特性研究,可以解释微生物在环境中的变化,对于土壤微生物群落的研究具有重要意义.     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

萘降解质粒pND6-1中萘趋化基因nahY的克隆和核苷酸序列分析

假单胞菌（Pseudomonas）ND6菌株的萘降解基因位于102kb的质粒pND6-1上。以pUC18质粒为载体，制备了含有1.5-3.0kbpND6-1DNA随机片段的基因文库。通过DNA测序和DNA序列的同源性分析，从基因文库中筛选出含有萘趋化基因nahY的克隆。NahY基因的大小为1617bp，编码的萘趋化蛋白由538个氨基酸组成，与假单胞菌G7菌株的nahY基因相比，核苷酸序列的同源性是96.7％，编码的氨基酸序列的同源性是95％。图4参7     

汕头海域几丁质酶产生菌的筛选及其几丁质酶编码基因研究

在汕头海域表层沉积物中分离得到69株高产几丁质酶的菌株,对其中6株形态特征差异比较明显、几丁质酶活力比较高的菌株SWCH-1、SWCH-2、SWCH-3、SWCH-5、SWCH-6和SWCH-9进行了16S rDNA序列鉴定,发现它们分别归属于5个属.即短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas).采用兼并引物对6株菌几丁质酶编码基因的催化保守区片段进行了PCR扩增和序列分析,发现菌株均含有18家族几丁质酶编码基因;但是其编码的蛋白序列与NCBI收录的蛋白序列存在着差异,其中菌株SWCH-1和SWCH-3的蛋白序列与数据库中序列的相似性比较低,分别为85%和81%,菌株含有比较新的几丁质酶编码基因,其全基因序列的克隆和酶蛋白的纯化分析尚在进一步研究中.图6参18     

一株菲降解菌的分离鉴定及其降解条件研究

以菲为研究对象,从克拉玛依稠油污染土壤中筛选到1株对菲具有较好降解效果的菌株JZ3-21。通过形态观察、生理生化指标及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定。该株菌的16S rDNA序列与Pseudomonas属的相似性达99%,结合分离菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列的分析结果,初步鉴定该菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida.）。对其降解条件进行了研究,结果表明：在40℃,pH 8.0,接种量为1.5%的条件下,菌株对初始质量浓度为100 mg.L-1的菲在64 h内的降解率高达94.2%。该菌对高质量浓度菲有较好的耐受性,其最高耐受质量浓度可达2 000 mg.L-1。     

云南腾冲热泉极端嗜酸热硫化叶菌多样性研究

硫化叶菌(Sulfolobus)是极端嗜热古菌遗传机制研究的重要模式菌株,广泛分布于酸性热泉中.对分离自云南腾冲酸性热泉的11株极端嗜酸热菌株进行16S rRNA基因序列测定,并通过菌体形态观察、16S rRNA基因可变区序列比较、菌株16S rRNA基因相似性比较及系统发育分析,研究腾冲热泉硫化叶菌的多样性.结果表明,分离自腾冲热泉的11株硫化叶菌的16S rRNA基因序列与分离自世界上其它地区的8个硫化叶菌的标准菌株的相似性为85.8%～94.9%,与同样分离自腾冲热泉的S.tengchongensis标准菌株的相似性为96.6%～97.5%,在分类学上具有形成新种的可能.在16S rRNA基因高可变区序列上,与分离自世界上其它地区的8个硫化叶菌的标准菌株存在明显的差异.系统发育分析表明,分离自腾冲热泉的硫化叶菌在系统发育树上形成两个亲缘关系较为紧密的簇群,可见腾冲热泉硫化叶菌不仅具有一定的多样性,同时具有较明显的地域性特征.     

荧光假单胞菌高效广谱载体的构建及分析

为促进高GC含量基因在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达效果更加理想、操作更加简便,本研究首先采用不依赖基因序列和连接反应的克隆(Sequence and ligation independent cloning,SLIC)方法将载体pCIBhis上与复制相关的序列和标记基因片段构建成克隆载体pCIBS1.然后优化荧光假单胞菌转化方法,用电转化法将pCIBS1导入荧光假单胞菌BL915中,随后又将T7和tac基因启动子分别插入pCIBS1中,成功构建了表达载体pCIBS3和pCIBS2.研究发现载体pCIBS1在大肠杆菌和荧光假单胞菌中均较为稳定,并且将绿色荧光蛋白基因插入表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,验证了表达载体功能.本研究构建的表达载体和建立的荧光假单胞菌BL915电转化方法,为高GC含量基因在荧光假单胞菌中的表达奠定了基础.     

甲苯降解菌JB-1的分离、鉴定与降解特性

从南京石化废水处理池的活性污泥中分离到1株能以甲苯为唯一碳源生长的细菌,命名为JB-1.根据其生理生化特征和16SrDNA(GenBank Accession No. EU869278)序列相似性分析,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).该菌株在18h内能完全降解346.4mg/L的甲苯.降解甲苯的最适温度为30℃,pH为7.0,降解速率与初始接种量呈正相关.甲苯降解途径是通过甲苯双加氧酶形成顺甲苯二氢二醇,再经邻苯二酚2,3双加氧酶开环降解.     

澳洲野生稻(Oryza australiensis)内生固氮菌的分子鉴定及发育分析

采用两种无氮培养基经平板划线法共分离筛选到澳洲野生稻(Oryza australiensis)45株内生固氮菌.利用全细胞蛋白电泳和插入序列指纹图谱对获得的内生固氮菌进行聚类分析,将其分为8个类群.其中类群Ⅰ有10株菌,类群Ⅱ为4株菌,类群Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ均为3株菌,类群Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ各有2株菌.对分离得到的内生固氮菌主要类群部分代表菌株的固氮活性进行了系统研究,结果表明,菌株在偏酸(pH值5.0)和偏碱(pH值9.0)的条件下均能保持较高的固氮酶活性,NaCl浓度在2%时达到最高固氮活性,NH4+浓度达到7.5 mmol/L时,均无固氮酶活性,不同菌株所能利用的碳源不同.16S rDNA序列测定及系统发育分析显示:类群ⅠYH39与Burkholderia cepacia ATCC 25416T相似性为97%;类群Ⅱ为克雷白氏杆菌属(Klebsiella),相似性为100%;类群Ⅲ为泛菌属(Pantoea),相似性为99%;类群Ⅴ为草螺菌属(Herbaspirillum),相似性为99%;类群Ⅶ为中华根瘤菌属(Sinorhizobium),相似性为99%.本研究表明澳洲野生稻内生固氮菌资源具有遗传多样性.图5表1参26     

植物中3-磷酸甘油脱氢酶基因家族的物种特异性进化分析

3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是一种在磷酸甘油酯的代谢过程中起重要调节作用的关键酶,研究植物中3-磷酸甘油脱氢酶基因家族的进化历史及其多样性对进一步探索其作用机制具有重要意义.以20个已报道的GPDH基因作为查询序列,与19种代表性的植物物种的基因组分别进行BLASTP和t BLASTN比对以及隐马尔科夫模型搜索,获得基因家族新成员,构建系统发育树,并对其进行基因结构、蛋白模体、功能差异性以及适应性进化分析.预测得到了75个新的GPDH基因家族成员,系统发育分析表明,植物中的GPDH基因属于3个单系类群(命名为族群I、族群II和族群III),并且在进化过程中主要分为两个进化枝,说明GPDH基因家族源自两个GPDH祖先基因;功能差异性分析表明,氨基酸特异性位点的选择性约束作用于不同族群的GPDH基因上,并且导致了不同族群多样化之后的特异性进化,同时,在族群I/III和族群II/III中也发现了Type-II功能差异性,表明氨基酸的理化性质也发生了本质的改变;适应性进化分析以及ka/ks比值分析表明,GPDH基因家族在物种特异性复制之后的进化过程中受到了纯化选择作用.因此,GPDH基因家族在其进化过程中受到不同的选择压力而出现了不同的进化方向,形成了多样化的族群.此外,对该基因家族进行的系统的分子进化探索为植物中GPDH基因家族的进一步生物化学和遗传方面的研究以及基因组分析提供了数据基础,在GPDH基因家族分析中的结果与发现也为研究其他基因家族提供了有力的帮助.