青枯雷尔氏菌GMll000菌株龙胆酸1，2-双加氧酶活性中心关键氨基酸残基的鉴定

生物信息学分析表明,位于青枯雷尔氏菌GMI1000菌株的染色体上的读码框RSc1087可能编码一个龙胆酸1,2-双加氧酶.本研究克隆、表达了该基因,并通过亲和层析对该基因表达产物进行了纯化.酶学测试结果证实,该基因编码的正是龙胆酸1,2-双加氧酶.SDS-PAGE结果表明,该酶亚基分子量约为38×103.基因的定点突变揭示105位、107位和146位组氨酸残基是该酶活性中心的关键氨基酸残基.     

反向PCR法克隆芳香烃龙胆酸降解途径中诱导型龙胆酸1,2-加双氧酶基因

龙胆酸1,2-加双氧酶(GDO)是芳香烃龙胆酸途径的一个关键酶.产碱假单胞菌P25X具有保守性与诱导性各一组GDO同工酶,突变株SNZ28的保守型龙胆酸1,2加双氧酶基因(GDOⅠ)被链霉素/奇霉素抗性基因打断,但在含有龙胆酸盐的基本培养基上,仍能明显观察到GDO的活性.由龙胆酸诱导生长的SNZ28全蛋白二维电泳结果分析,获得了一个与Ralstoniasp.U2的GDO酶有极高同源性的蛋白点.根据对该蛋白点的N端和Q-Tof测序的结果,设计了一对简并引物,克隆了诱导型GDO酶的片段,通过对此片段的分析,设计了逆向PCR引物,利用Southern blot杂交,确定了合适的限制性内切酶(SalⅠ和SphⅠ),以单一酶切的P25X基因组DNA自联后的产物为模板,进行反向PCR.测序表明,获得了一段1047bp与Ralstoniasp.U2.的龙胆酸1,2-加双氧酶具有极高同源性的序列.研究结果揭示了SNZ28中存在诱导型GDO酶.本文中也对不同来源的GDO酶进行了比较研究,其结果为进一步对生物降解基因的进化研究打下了基础.图4表2参16     

石油烃降解酶及其基因的结构、功能和表达调控

研究烃降解酶及其基因是进行石油微生物分子检测和工程菌构建的重要基础.本文对目前烃降解酶及其基因的结构、功能和调控机制的最新研究进展进行了总结.催化烷烃好氧降解的起始酶有几类加氧酶,膜整合甲烷单加氧酶、萘-1,2-双加氧酶和异丙苯双加氧酶的晶体结构已经被解析.烷基或芳基琥珀酸合酶催化烃厌氧代谢的主要起始反应,而Azoarcus sp.乙苯厌氧代谢起始反应由乙苯脱氢酶催化.在细菌中,烃代谢相关基因主要通过形成操纵子进行表达调控,基因转录受烃或类似物诱导,并受细胞全局调控.一些微生物由于存在多种烃代谢途径而可能具有复杂的基因调控机制.此外,生态学研究表明,环境中烃降解基因的诱导动态与实验室内纯培养分析不同.在分析石油降解工程菌构建有待解决问题的基础上,提出了烃代谢综合调控和环境中相关酶及基因诱导研究的重要性,并对未来烃降解酶及其基因在有毒物降解理论研究和生物修复上的应用进行了展望.     

深海细菌Celeribacter indicus P73~T对菲的降解机制

来自深海环境的多环芳烃降解菌Celeribacter indicus P73~T能够高效降解菲,为揭示菲生物降解的分子机制,对其降解途径进行分析.通过GC-MS联用技术鉴定出菌株P73~T降解菲的2个重要的中间代谢产物,1-羟基-2-萘甲酸和1-萘酚.通过分析菌株P73~T全基因组,发现了菲降解基因簇(P73_0346-P73_0354),编码包括环羟基化双加氧酶、二氢二醇脱氢酶、环裂解双加氧酶、异构酶、水合醛缩酶等.通过验证环羟基化双加氧酶大亚基基因突变株ΔP73_0346::kan的菲降解能力,证实基因P73_0346编码了菲双加氧酶.依据代谢物检测、基因组分析和突变株功能验证结果,推测菌株P73~T降解菲经由菲C3,4-双加氧途径,更进一步地确定了参与此途径的菲双加氧酶等降解相关基因.本研究不仅揭示了菲降解的分子机制,也为菲污染的生物修复技术提供了理论依据.     

菲降解菌的筛选鉴定及其降解酶基因的研究

经过富集从活性污泥中筛选出两株菲降解菌WSCII和WSCIII,经16SrDNA鉴定,它们分别属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp. )和假单胞菌属(Pseudomonassp. ),在28℃下4d内对菲( 0. 6g/L)的降解率分别达到了70. 9%和78. 1%;在LB、萘和菲为碳源的培养条件下,测得菌体的双加氧酶比活力不同.在菲的诱导下,两株菌的双加氧酶比活力最高,而以LB和萘为碳源时酶的比活力较低,其中WSCII在萘中不能生长;这表明该酶在两菌中皆为底物诱导表达.以其它菌的萘双加氧酶基因大亚基片段做模板制备异源探针,与两菌总DNA进行斑点杂交;结果表明,这两株菌可能含有不同的菲双加氧酶基因.利用简并引物进行PCR扩增菲双加氧酶,结果仅能从WSCIII的总DNA中扩增得到目的片段,序列分析证明,该基因与已报道的(P. putidaNCIB9816 -4, AF491307 )双加氧酶同源性最高为98%. 图5参10     

环戊酮和环己酮的微生物降解途径、相关酶和基因研究进展

简略介绍了环戊酮和环己酮的应用及危害,综述了目前国内外在环戊酮和环己酮微生物降解方面的研究进展.具体介绍了环戊酮和环己酮降解代谢的过程及其相关的酶类和编码这些酶的基因,重点阐述了环戊酮1,2-单加氧酶和环己酮1,2-单加氧酶及其编码基因.图4参19     

恶臭假单胞菌DLL-E4对硝基苯酚降解途径关键基因pnpC的突变分析

通过同源重组成功地敲除了恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)DLL-E4菌株的偏三苯酚1,2-双加氧酶基因(pnpC).pnpC插入失活菌株DLL-△pnpCl失去了降解对硝基苯酚(PNP)和对苯二酚(HQ)的能力,而pnpC敲除菌株DLL-△pnpC恢复了利用PNP和HQ的能力,但是降解速率降低.在不同硫酸铵分级梯度下PNP和邻苯二酚分别诱导的DLL-E4和DLL-△pnpC粗酶液对邻苯二酚的降解活性存在明显差异,表明恶臭假单胞菌DLL-E4中除pnpC参与PNP降解代谢过程外,还存在另一个双加氧酶替代了敲除的pnpC的功能,使得DLL-△pnpC代谢PNP的过程得以继续.     

金属离子对赤红球菌(Rhodococcus ruber L9)降解芘的影响及其作用机制

实验室从石油污染土壤中筛选得到一株高效芘降解菌,命名为赤红球菌(Rhodococcus ruber L9),分析了不同浓度Fe~(3+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)对该菌降解芘效果的影响.结果发现,0.45 mmol·L~(-1) Fe~(3+)对芘的降解率有明显促进作用,6d时芘降解率最高,可达77%,相较于不加金属离子时提升了约30%.进一步研究发现,当Fe~(3+)存在时,芘降解过程中蛋白总量变化、邻苯二酚1,2-双加氧酶(C120)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C230)酶活性的变化与Fe~(3+)和Fe~(2+)在胞内、胞外浓度的变化密切相关,主要原因是Fe~(3+)的存在,能诱导赤红球菌合成更多与芘降解有关的蛋白,且可以作为酶的活性中心提高酶的活性,从而大幅提高芘的降解效率.     

乙羧氟草醚降解菌Reudomonas sp.YF1的分离、鉴定与降解特性

从生产乙羧氟草醚工厂的污水处理池污泥中分离到一株乙羧氟草醚降解细菌,命名为YF1.根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列系统发育分析,将其鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).接种量为5%时,菌株YF1在含200 mg/L乙羧氟草醚的基础盐液体培养基中降解乙羧氟草醚,7 d后降解率约80%.加大接种量和外加营养碳氮源可以促进乙羧氟草醚的降解.该菌株降解乙羧氟草醚的最适pH为7.0,最适温度为30℃.菌株YF1能利用苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、苯甲酸、龙胆酸、对硝基苯酚和邻氯苯酚为底物生长,不能利用3-苯氧基苯甲酸为碳源生长,菌株YF1细胞内邻苯二酚1,2-双加氧酶受到乙羧氟草醚或其代谢产物的诱导.图5表1参25     

一株菲降解菌的特性及相关降解基因的克隆

从石油污染土壤中分离到一株菲降解菌2F5-2.根据该菌株生理生化特征和16S rDNA序列相似性分析,将其初步鉴定为鞘氨醇杆菌属(Sphingobium sp.).该菌株在10 h内对100 mg/L的菲的降解率为100%.降解菲的最适温度为30℃,最适pH为7.对降解途径的初步研究显示,该菌株通过水杨酸途径降解菲.克隆了编码芳香烃双加氧酶α亚基的基因phdA,它与菌株Sphingomonas sp.P2、Sphingobium yanoikuyae B1、Sphingomonas sp.ZP1中phdA的同源性分别为97.9%、98%和100%,表明该基因具有保守性.图6参16     

茄科雷尔氏菌蛋白质相互作用网络预测及分析

细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界范围的细菌性土传病害.该细菌基因组序列的完全测序,使得从蛋白质组角度来分析其蛋白质相互作用网络成为可能.本文通过朴素贝叶斯模型整合系统发生谱法、基因邻近法、基因融合法、操纵子法、同源映射法、微阵列法、域相互作用法等7种方法,并根据约豋指数确定的阙值,预测了可信的茄科雷尔氏菌的蛋白质相互作用网络.对网络中的分泌子网络和信号转导进行了分析,提出可能的药物作用靶点(cyaB、pilD、Fli、Rsp1526、VsrA、VsrB、PilH).对于未注释的蛋白依据蛋白相互作用推测了部分蛋白质的功能.本文也提供了完全免费的在线数据库支持,提供了方便的茄科雷尔氏菌的蛋白相互作用的查询及相互作用数据和推测的蛋白质功能数据的查询和下载(http://www.scbmp.org.cn/rsoppi.php).     

应用高效离子交换色谱分析青枯菌的致病力分

应用高效离子交换色谱和激光光散射仪检测器对不同致病力的青枯菌进行分析,建立了一种快速检测青枯菌致病力分化的新方法青枯菌纯培养物经过高效离子交换色谱分离得到3个致病力不同的特征峰,大小依次为峰3组分>峰2组分>峰1组分.对10株青枯菌进行色谱分析,并结合番茄组培苗感染试验检测其致病力,结果发现,强致病力菌株经过色谱分离只在峰3的保留时间位置出现单一特征峰,在9 d内即可引起100%的番茄组培苗发病;若菌株经过色谱分离形成3个特征峰,则峰3所占的面积比越大,该菌株的致病性相对就越强.25株不同致病力青枯菌的验证试验表明了该方法的可行性,番茄组培苗发病率x与峰3面积比y之间呈现出良好的线性关系,回归方程y=0.9581x+5.4984,相关系数r=0.986.通过对青枯菌色谱行为、致病力、细胞表而黏附的EPS Ⅰ含量三者之间相互关系的进一步研究,发现青枯菌的致病力越强,则细胞表面黏附的EPSⅠ越多,峰3所占的面积比就越大.图3表6参15     

一株拮抗烟草青枯病菌的真菌的筛选与鉴定

为寻找烟草青枯病的生防微生物,研究采用平板涂布法从重庆烟田健康土壤中分离根际微生物,纯化后得到了59株真菌。用滤纸片法从中筛选出1株对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）有稳定拮抗效果的真菌,其抑菌圈为10.0 mm。其抑制活性优于或接近于近期发现的其他生防微生物。测定该株活性真菌的全细胞脂肪酸组成,进行菌落和分生孢子形态学观察,以及rDNA ITS区测序,结果表明：该菌株全细胞脂肪酸属性未被收录于TSBA6脂肪酸数据库,而根据形态学观察结果,以及对所获rDNA ITS区序列的分析,鉴定该株真菌为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。     

Multistep conversion of cresols by phenol hydroxylase and 2,3-dihydroxy-biphenyl 1,2-dioxygenase

A mulfistep conversion system composed of phenol hydroxylase （PHrND） and 2,3-dihydroxy-biphenyl 1,2-dioxygenase （BphCLA_4） was used to synthesize methylcatechols and semialdehydes from o- and m-cresol for the first time. Docking studies displayed by PyMOL predicted that cresols and methylcatechols could be theoretically transformed by this multistep conversion system~ High performance liquid chromatography mass spectrometry （HPLC-MS） analysis also indicated that the products formed from multistep conversion were the corresponding 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 2- hydroxy-3-methyl-6-oxohexa-2,4-dienoic acid （2- hydroxy-3-methyl-ODA） and 2-hydroxy-5-methyl-6-oxo- hexa-2,4-dienoic acid （2-hydroxy-5-methyl-ODA）. The optimal cell concentrations of the recombinant E. coli strain BL21 （DE3） expressing phenol hydroxylase （PHrND） and 2,3-dihydroxy-biphenyl 1,2-dioxygenase （BphCLA_4） and pH for the multistep conversion of o- and m-cresol were 4.0 （g-L-1 cell dry weight） and pH 8.0, respectively. For the first step conversion, the formation rate of 3- methylcatechol （0.29μmol·L-1·min-1·mg-1cell dry weight） from o-cresol was similarly with that ofmethylca- techols （0.28 μmol·L-1·min-1·mg-1 cell dry weight） from m-cresol by strain PHrND. For the second step conversion, strain BphCLA_4 showed higher formation rate （0.83 μmol·L-1·min-1·mg-1 cell dry weight） for 2-hydroxy-3-methyl- ODA and 2-hydroxy-5-methyl-ODA from m-cresol, which was 1.1-fold higher than that for 2-hydroxy-3-methyl- ODA （0.77 μmol·L-1·min-1·mg-1. mglcell dry weight） from ocresol. The present study suggested the potential application of the multistep conversion system for the production of chemical synthons and high-value products.     

Ralstonia sp.strain U2菌株对萘的趋化作用

一株降解萘的细菌Ralstonia sp. strain U2对萘具有趋化现象,萘、水杨酸都可以作为其对萘产生趋化现象的诱导物.U2菌对水杨酸、龙胆酸同样都具有趋化性,但这种趋化性是组成型的,不需要诱导.图3参22     

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物，以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O)基因，将该基因和表达载体pET—30a( )连接，转化E.coli JM109(DE3)，获得了高效表达的转化子，SDS—PAGE结果表明，转化子的C23O蛋白不仅在细胞内存在，而且能被分泌到胞外，薄层扫描显示，转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的42％，酶活分析表明，分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C23O比活力，Southern杂交将菌株ZL5的C23O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上。图5表1参12。     

Direct sampling and in situ observation of a persistent copepod aggregation in the mesopelagic zone of the Santa Barbara Basin

Observations from a one-person submersible (Wasp) in fall, 1982, revealed a persistent aggregation of non-migrating, Stage V copepodites of Calanus pacificus californicus Brodsky in a band 20±3 m thick at a depth of 450 m, about 100 m above the bottom of the Santa Barbara Basin, California. Copepod abundances, calculated from nearest-neighbor distances measured directly from the submersible, yielded maximum densities of 26×10⁶ copepodites m^-3. Quiescent behavior, low laminarinase activity, low protein content, high lipid content and evidence of low excretion rate all suggest that these copepodites were in a state of diapause. Diapausing C. pacificus californicus at other locations along the eastern Pacific coast were also captured in discrete depth plankton tows. Both the submersible observations and the net collections suggest that the dense aggregation of diapausing copepods we observed in the Santa Barbara Basin was a phenomenon associated with seasonal upwelling cycles, and that such aggregations occur during non-upwelling periods when food is scarce in surface waters. Numerous predators, especially the deep sea smelt Leuroglossus stilbius, were observed feeding upon the aggregated copepods; thus, in contrast to the conventional picture of surface-dominated food distribution, deep-water aggregations of C. pacificus californicus may support the mesopelagic community during periods of low food availability in surface waters.     

DEHP对小鼠精原细胞Bax和Bcl-2表达水平的影响

邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)因在环境中的广泛分布而受到普遍关注。为探究DEHP对雄性生殖细胞的毒作用机制,将小鼠精原细胞(GC-1spd)分别暴露于终浓度为0(对照)、10、100、1 000 mg·L~(-1)DEHP的培养基中培养24 h,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞相对活力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2m RNA的表达情况及Western blot技术检测Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。结果显示:在检测细胞相对活力时,1 000 mg·L~(-1)剂量组明显低于其他各剂量组,100 mg·L~(-1)剂量组低于对照组和10 mg·L~(-1)剂量组(P<0.05);在检测细胞凋亡时,1 000 mg·L~(-1)剂量组早期凋亡率高于对照组(P<0.05);晚期凋亡率1 000 mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1)剂量组均明显高于对照组,1 000 mg·L~(-1)剂量组高于10 mg·L~(-1)剂量组(P<0.05);总凋亡率呈现明显上升趋势,其中1 000 mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1)剂量组明显高于对照组,1 000mg·L~(-1)剂量组还明显高于10 mg·L~(-1)剂量组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示:Bax m RNA表达水平1 000 mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1)剂量组明显高于对照组,1 000 mg·L~(-1)剂量组与10 mg·L~(-1)剂量组比较差异具有统计学意义(P<0.05);Bcl-2 m RNA表达水平1 000 mg·L~(-1)剂量组低于10 mg·L~(-1)剂量组和对照组(P<0.05)。此外,Bax和Bcl-2 m RNA比值1 000 mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1)剂量组均明显高于对照组,1 000 mg·L~(-1)剂量组高于10 mg·L~(-1)剂量组(P<0.05)。Western blot结果显示,Bax蛋白表达水平1 000 mg·L~(-1)剂量组高于对照组(P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平各剂量组与对照组相比差异均具有统计学意义,且1 000mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1)剂量组明显低于10 mg·L~(-1)剂量组和对照组(P<0.05);此外,Bax/Bcl-2两蛋白比值1 000 mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1)剂量组明显高于对照组,而1 000 mg·L~(-1)剂量组高于10 mg·L~(-1)剂量组(P<0.05)。结果表明:DEHP可诱导小鼠精原细胞相对活力下降,通过抑制Bcl-2 m RNA和Bcl-2蛋白表达及促进Bax m RNA和Bax蛋白表达实现诱导精原细胞凋亡。     

Uptake,metabolism and discharge of polycyclic aromatic hydrocarbons by marine fish

The uptake, metabolism and discharge of two polycyclic aromatic hydrocarbons, ¹⁴C-naphthalene and ³H-3,4-benzopyrene, were studied in 3 species of marine fish (mudsucker or sand goby, Gillichthys mirabilis; sculpin, Oligocottus maculosus; sand dab, Citharichthys stigmaeus). The path of hydrocarbons through the fish included entrance through the gills, metabolism by the liver, transfer of hydrocarbons and their metabolites to the bile, and, finally, excretion. The gall bladder was a major storage site of labeled hydrocarbons and their metabolites. The major product of ²H-3,4-benzypyrene metabolism was tentatively identified as 7,8-dihydro-7,8-dihydroxybenzopyrene. The ¹⁴C-naphthalene was metabolized to 1,2-dihydro-1,2-dihydroxynaphthalene after 24 h exposure. The urine appeared to the major avenne for discharge of labeled hydrocarbon from the body. Our laboratory results indicated that certain polycyelic aromatic hydrocarbons were rapidly taken up from seawater by the above fish, but detoxification mechanisms existed for efficient removal of these compounds from their body tissues.