Pseudomonas sp.JM2菲降解酶基因解析

Pseudomonas sp.JM2是一株新发现的菲好氧高效降解菌,文章通过对该菌株菲降解基因簇的解析,发现降解关键酶基因均处于质粒上。获得了该菌菲双加氧酶、顺-3,4-二氢二羟基菲脱氢酶、3,4-双羟基菲双加氧酶、2-羟基-2H-苯芘[h]色原烯-2-羧酸盐异构酶、水合-醛缩酶、1-羟基-2-萘甲醛脱氢酶、1-羟基-2-萘甲酸双加氧酶、反式-2'-羧基苄基丙酮酸水合-醛缩酶、2-羧基苯甲醛脱氢酶的基因序列。通过与14种多环芳烃降解菌的基因序列比对,发现JM2降解关键酶的基因序列与产碱杆菌AFK2有96%的同源性,而与同种属的假单胞菌的同源性仅有约55%。进一步用同源模建的方法获得了JM2菲双加氧酶α亚基的关键氨基酸,并结合已知的代谢产物分析,推测该菌株通过邻苯二甲酸途径降解菲,该降解途径与目前已知的假单胞菌菲降解途径不同。实验结果对于评价JM2菲降解物的环境影响、进一步通过基因调控和改造提高JM2的降解能力奠定了基础。     

玉门油田污染荒漠土壤石油降解菌多样性

为探索石油污染荒漠土壤石油降解微生物多样性、筛选高效石油降解菌,采用涂布平板法从石油污染荒漠土壤分离具有石油降解能力细菌,采用细菌形态观察和16S rRNA基因序列分析其多样性,并设计特异性引物,对分离细菌降解相关基因进行检测.结果表明,分离的37株细菌分别属于放线菌纲(Actinobacteria)、γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β变形菌纲(Betaproteobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和α变形菌纲(Alphaproteobacteria),分别占35.14%、32.43%、13.51%、13.51%、5.41%,归属于21个属的34个种类.优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)和葡萄球菌属(Staphylococcus),占总数的51.35%,其中有36株细菌能以石油为唯一碳源稳定生长,对原油有明显的降解能力.在石油质量浓度为1 500 mg/L的基础培养基中,菌株YM43在培养7 d后对石油的降解率达55.47%,另有8株细菌的降解率不低于30.55%,11株细菌的降解率介于10.05%~28.37%,18株细菌的降解率不高于8.05%. PCR检测表明,有25株细菌含有烷烃单加氧酶基因,6株含芳烃双加氧酶基因,6株含联苯双加氧酶基因,4株含萘双加氧酶基因,3株含甲苯双加氧酶基因,2株含邻苯二酚双加氧酶基因.研究显示,石油污染荒漠土壤中可培养细菌具有高度多样性,分离的菌株有较强的石油降解能力,其降解功能与所存在的降解基因有关.      

降解芘的分枝杆菌M11的分离鉴定和降解特性

从多环芳烃污染的土壤中分离到1株能高效降解四环芳烃芘的放线菌M11,经形态观察、生理生化和16S rDNA鉴定,属于分枝杆菌属(Mycobacterium sp.).菌株M11能以菲、蒽、荧蒽和芘为唯一碳源生长,在含芘50、100和200 mg/L的无机盐液体培养基中培养16 d降解率分别达到76.9%、91.8%和79.23%.菌株M11对芘的降解具有较广泛的pH范围,在芘浓度100 mg/L,pH为5～9的液体条件下,均可生长.根据已报道的芘降解菌的双加氧酶同源序列设计引物,PCR扩增出编码双加氧酶大亚基和小亚基的基因片段,序列分析表明与已知降解芘的分枝杆菌的双加氧酶基因具有高度同源性.     

产生物表面活性剂石油降解菌株筛选及降解特性

首先从曹妃甸港石油污染区采样,筛选到两株降解率较高的产生物表面活性剂石油降解菌株,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa1)和假单胞菌(Pseudomonassp,Ps1),经过10 d的降解实验,Pa1的降解率达到了63.28%,Ps1的降解率达到了65.86%。然后对此菌株进行紫外诱变,其降解率都有显著的提高,Pa1的降解率为71.28%,Ps1的降解率为74.24%。最后进行菌株的组合,两株的混合菌株降解率为76.05%,表明混合菌株的降解率比单个的菌株高;同本室筛选的石油降解菌S1的组合,其降解率提高到81.45%。本实验为产生物表面活性剂菌株与石油降解菌的混合菌群组合降解提供了依据。     

两株假单胞菌降解酚类化合物的特性

从焦化废水中分离得到2株可降解对氯酚的假单胞菌(Pseudomonas)CO-1和CO-44.其最适降解温度为35~40℃,最适pH值为6.0~8.0.菌株降解对氯酚的速度与对氯酚初始浓度呈负相关.2株细菌均能较快地降解苯酚和甲酚,其中CO-1还能够降解1-萘酚和萘.在添加对氯酚的焦化废水中,CO-1和CO-44能够在42h内将苯酚、甲酚和对氯酚完全降解.从2株细菌中均检测到了苯酚羟化酶基因,分别从菌株CO-1和CO-44中检测到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因和邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.     

两株降解芘的分枝杆菌的筛选鉴定及降解性能

为获得芘降解细菌,从中国南方地区采集了受PAHs严重污染的土壤与污泥样品.利用平板升华法,分离到2个菌株W52和W74.经形态观察、生理生化试验和16S rDNA的序列分析,2个菌株被鉴定为分枝杆菌属(Mycobacterium sp.).在含芘膜的固体平板上培养,W52和W74在23d中降解芘分别达到13.2Iμg和11.8μg.在含芘50mg·L-1和lOOmg·L-1的无机盐液体中培养,2d时W52的芘降解率达57.8%和20.5%.W74达19.2%和4.O%;随着培养时间的延长,芘降解率不断提高;在第10ci时W52的芘降解率分别达到96.3%和82.3%,W74达83.8%和64·5%.在固体和液体条件下降解芘的结果表明,W52降解芘的能力强于W74.鉴于W52和W74末端双加氧化酶中编码a大亚基的nida基因存在明显差异,推断二者降解芘的能力不同与它们的末端双加氧酶有关.     

降解蒽嗜盐菌AD-3的筛选、降解特性及加氧酶基因的研究

蒽是典型的多环芳烃类环境污染物,属于美国EPA优先控制的16种多环芳烃类化合物,其在高盐环境下的生物降解备受关注.本研究从某石油污染的高盐土壤中成功筛选出了1株高效降解蒽的菌株,经过对其生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定并命名该菌株为Martelella sp.AD-3.该菌株在0.1%～10%的盐度和6.0～10.0的pH范围内,均能够降解蒽.其生长和降解蒽的优化条件是:蒽初始浓度25 mg·L-1、温度30℃、pH值9.0和盐度3%,在优化条件下培养6 d,蒽的降解率可达到94.6%.根据已报道的双加氧酶α亚基的同源性设计简并引物,通过巢式PCR扩增获得双加氧酶基因的部分序列307 bp(GenBank:JF823991.1),与海杆菌属Marinobacter sp.NCE312(AF295033)菌株萘双加氧酶大亚基的部分氨基酸序列同源性最高为95%.     

1株铜绿假单胞菌对芘的降解特性及代谢途径

多环芳烃（PAHs）因其具有"三致"作用对生态系统产生潜在威胁.微生物降解是多环芳烃降解的主要途径之一,筛选出能高效降解多环芳烃的菌株是微生物修复技术的关键.本文采用富集培养的方法从多环芳烃污染的污泥中分离到1株以芘为唯一碳源的菌株LX2,经形态观察、生理生化和16S rDNA鉴定,LX2属于铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.LX2）.菌株在含芘浓度为50 mg·L^-1的无机盐液体培养基中培养21 d对芘的降解效率达32.1%.经GC-MS分析发现,Pseudomonas sp.LX2降解芘的中间代谢产物主要有4,5-二氢芘、2''-羟基苯丙酮、苯酚、原儿茶酚.基于鉴定的代谢产物得出芘通过"萘"和"邻苯二甲酸"两种不同的途径被铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.LX2）降解.     

1株筛自柴油污染土壤的铜绿假单胞菌对萘的降解特性研究

从柴油污染土壤中筛选分离出1株萘降解菌HD-5,经16S r DNA序列分析鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),对功能基因进行PCR扩增证实该菌株中含有萘双加氧酶基因nah.采用生物强化、生物刺激以及二者相结合的方式修复萘含量为0.5%的自配污染土壤,综合比较了在不同修复方式下土壤中萘的降解率,修复过程中土壤FDA水解酶活和脱氢酶活的变化,以及运用定量PCR的方法动态分析了总细菌基因拷贝数和nah基因拷贝数.结果表明,在生物强化(B)、生物刺激(S)以及生物强化与生物刺激相结合(BS)这3种修复方式下,31 d后萘去除率分别为71.94%、62.22%和83.14%,BS组在修复过程中土壤FDA水解酶活和脱氢酶活明显高于另外两组,31 d后BS组土壤中总细菌基因拷贝数和nah基因拷贝数分别增长了约2.67×1011g-1和8.67×108g-1.上述研究结果表明筛选得到的萘降解菌株在土壤中具有良好的定植特性,在生物刺激与该降解菌株的共同作用下,可以有效地实现土壤中萘降解,这对此类污染生物修复过程研究具有一定的指导意义.     

高效石油降解菌的选育及其降解特性研究

从石油化工厂附近的污染土壤中分离到三株石油降解菌w1、w2和w3,经鉴定分别是不动杆菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。初步研究了菌株的生长特性与其降解石油能力的关系,并将w1和w2进行紫外诱变得到诱变菌yw1和yw2。对诱变前后的菌株进行石油降解实验,结果表明,诱变前的菌株在原油浓度为4000mg/L培养液中培养10d,原油的降解率分别为74.34%和77.58%。而诱变菌株10d降解率达到了79.9%和87.3%。同时,诱变菌株还大大提高了对高浓度石油的耐受能力。     

两种植物根际促生菌对博落回抗干旱及富集铀性能的增强作用研究

采用土壤盆栽试验,通过在博落回(Macleaya cordata)根际单独接种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、单独接种绿针假单胞菌橙色亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca)及同时接种这两种菌,研究了这两种植物根际促生菌对博落回抗干旱及富集铀性能的增强作用.结果表明:在干旱胁迫下,单独接种荧光假单胞菌、单独接种绿针假单胞菌橙色亚种及同时接种这两种菌后,博落回的生物量分别增加了35.03%、21.01%和17.33%,相对含水量分别增加了26.90%、19.31%和29.48%,叶绿素总量分别增加了71.11%、48.47%、12.85%,脯氨酸含量分别降低了71.70%、64.91%和61.35%.在干旱和铀同时胁迫下,单独接种荧光假单胞菌、单独接种绿针假单胞菌橙色亚种及同时接种这两种菌后,博落回对铀的总富集量分别提高了109.52%、66.67%和42.86%.可见,两种植物根际促生菌对博落回抗干旱和富集铀性能的增强作用表现为:单独接种荧光假单胞菌单独接种绿针假单胞菌橙色亚种同时接种这两种菌.实验结果可为干旱地区铀污染土壤的植物修复提供参考.     

Non-specific association between filamentous bacteria and fungus-growing ants

Fungus-growing ants and their fungal cultivar form a highly evolved mutualism that is negatively affected by the specialized parasitic fungus Escovopsis. Filamentous Pseudonocardia bacteria occurring on the cuticle of attine ants have been proposed to form a mutualistic interaction with these ants in which they are vertically transmitted (i.e. from parent to offspring colonies). Given a strictly vertical transmission of Pseudonocardia, the evolutionary theory predicts a reduced genetic variability of symbionts among ant lineages. The aim of this study was to verify whether actinomycetes, which occur on Acromyrmex octospinosus leaf-cutting ants, meet this expectation by comparing their genotypic variability with restriction fragment length polymorphisms. Multiple actinomycete strains could be isolated from both individual ant workers and colonies (one to seven strains per colony). The colony specificity of actinomycete communities was high: Only 15% of all strains were isolated from more than one colony, and just 5% were present in both populations investigated. Partial sequencing of 16S ribosomal deoxyribonucleic acid of two of the isolated strains assigned both of them to the genus Streptomyces. Actinomycetes could also be isolated from workers of the two non-attine ant species Myrmica rugulosa and Lasius flavus. Sixty-two percent of the strains derived from attine ants and 80% of the strains isolated from non-attine ants inhibited the growth of Escovopsis. Our data suggest that the association between attine ants and their actinomycete symbionts is less specific then previously thought. Soil-dwelling actinomycetes may have been dynamically recruited from the environment (horizontal transmission), probably reflecting an adaptation to a diverse community of microbial pathogens.     

拟柱孢藻生长及碱性磷酸酶活性对不同磷浓度和磷形态响应的株系间差异

拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)是热带地区普遍存在的蓝藻种类,近年来广泛扩张到温带地区水体,耐受低磷环境和多生态型的存在被认为是该藻能成功入侵的重要原因.为进一步了解不同藻株对磷波动的生理响应是否存在差异,本研究以广东省镇海水库分离的4株拟柱孢藻(N1、 N8、 N9和N10)为材料,观测它们的生长和碱性磷酸酶(ALP)活性在不同无机磷(Pi)浓度(HP=7.13 mg·L~(-1)、 MP=0.64 mg·L~(-1)、 LP=0.03 mg·L~(-1))和磷形态[磷酸氢二钾(K_2HPO_4)、焦磷酸钾(K_4P_2O_7)、三聚磷酸钾(K_5P_3O_(10))、 D-葡萄糖-6-磷酸(D-G-6-P)、三磷酸腺苷(ATP)、环磷酸腺苷(cAMP)]的变化.结果表明, 4株拟柱孢藻的生长对Pi浓度变化的响应基本一致,即它们的生物量都随Pi浓度的升高而增加,而ALP活性则反之;无论在LP、MP或HP条件下,N8藻株的ALP活性均显著低于其他3藻株,表明该藻株更能适应环境中的磷波动.在不同磷源培养下,拟柱孢藻N8和N9在3种无机磷下的生物量显著高于3种有机磷组,两者的比生长速率在K_2HPO_4最高,在ATP中最低,这表明拟柱孢藻偏好无机磷,但也能利用有机磷生长;在有机磷源条件下,N8藻株在ATP中的ALP活性显著高于其他2种有机磷,而N9藻株的ALP活性在3种有机磷培养下无显著差异,这表明N8藻株对无机磷缺乏的响应较N9藻株更为敏感.本结果表明来源于同一水库的拟柱孢藻藻株间存在显著差异,其中N8藻株对磷浓度变化的适应及响应能力均高于其它藻株.株系差异性的存在有利于拟柱孢藻适应各种环境变化,增强自身的竞争优势.     

石油污染土壤的生物整治研究

对被石油污染的包气带土层中微生物生态分布特性进行了调查，并从该土层中分离出１５９株烃降解细菌和真菌，其中１７株可以不同程度地分别利用烷烃（ｎＣ９～ｎＣ１８）和芳烃（酚、萘、甲苯和二甲苯）作为唯一碳源生长，在最适氮源和磷源的条件下，假音胞菌在５２在７ｄ内可利用石蜡作为碳源，生物量连续增加；３ｄ可将初始浓度为５００ｍｇ／Ｌ的机油降解９９％，投加选育出的混合菌株，进行土壤石油污染的生物整治模拟试验，结果     

石油降解菌的分离鉴定及4株芽胞杆菌种间效应

通过富集培养和分离纯化的方法,从天津大港油田石油污染土壤和渤海海上钻井平台洗油污水中分离出6株石油降解细菌,生理生化试验及16S r DNA序列分析鉴定表明,它们分别属于Bacillus芽胞杆菌属(S1、S2、S3、S4)、Pseudomonas假单胞菌属(W1)和Ochrobactrum苍白杆菌属(W2),其中,S3具有最高的烷烃(41.3%)和芳烃(30.9%)降解率,从石油污染场地中筛选出的内源微生物对本油田石油的降解效果优于外源物种.对4株芽胞杆菌属菌株构建微生物组进行石油降解实验,结果表明,由S1和S4构成的微生物组F3具有最高的烷烃(50.5%)和芳烃(54.0%)降解率,比单菌降解率分别提高了69.9%和156.1%,同时比最优降解单菌S3的降解率分别高出22.1%和74.6%,而由S2和S3构成的微生物组F4对烷烃和芳烃的降解率最低,分别为18.5%和18.9%,比单菌降解率降低了55.3%和39.0%,实验表明同菌属微生物种间对石油的降解同时存在协同促进和拮抗抑制作用,芽胞杆菌属内亲缘性近的菌株之间对石油降解主要表现为促进作用.     

攀枝花矿区糙野青茅根际耐铬放线菌筛选及促生能力评价

从攀枝花矿区糙野青茅根际土中分离放线菌,筛选获得对重金属铬具有强耐受性、抗菌促生和产胞外酶能力的放线菌,为微生物-植物联合修复重金属污染提供菌种资源.采用稀释涂布法进行放线菌的分离,通过放线菌在不同铬浓度高氏一号培养基上的生长状况判断其对重金属铬的耐受性,进一步采用原子吸收分光光度法分析菌株对铬耐受性强的菌株耐铬及去铬能力;通过对菌株产铁载体、溶磷、产吲哚乙酸(IAA)、产纤维素酶、产淀粉酶、产木糖酶、产酪蛋白酶能力及抗菌活性的筛选,综合评价菌株抗菌促生能力.结果显示,分离获得的27株根际菌株,光学显微形态及扫描电镜结果均显示为放线菌,其中有14株能在含铬的培养基上生长,具有耐铬能力.16S rRNA基因测序结果显示,14株放线菌分属于链霉菌属(streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)和冢村氏菌属(Tsukamurella).菌株SCAU9002和SCAU9008在铬浓度为300mg·L~(-1)的处理下培养6 d,去铬率分别达到81.17%和78.41%;菌株SCAU9002、SCAU9006、SCAU9008、SCAU9009、SCAU9013同时具有3种促生功能,盆栽实验结果进一步表明,在重金属胁迫下,经菌株处理后的玉米植株更高,生物量更大,根系更发达,促生效果较好.此外,菌株SCAU9006对6种病原菌具有拮抗作用,5株菌同时具有3种及以上产胞外水解酶的能力,4株菌能在7%的NaCl浓度下生长,13株菌在pH5.0~8.0的范围内均可生长.结果表明,根际放线菌在促进矿区植物生长和铬尾矿污染土壤的生物修复研究中具有很大潜力.     

2株苯胺降解的分离鉴定及其降解特性研究

从处理印染废水的活性污泥中分离得到2株苯胺降解菌,从菌落、细胞形态、生理生化及16S rRNA基因扩增测序等方面对2株菌进行了鉴定,并比较分析2株菌在好氧与缺氧条件下的苯胺降解、偶氮染料脱色及苯胺脱氨氧化酶基因tdnQ和黄素还原酶基因(fre)的携带情况.结果表明,2株菌属于Pseudomonas属和Shewanella属,分别命名为Pseudomonas sp.AN30和Shewanella sp.DN425.AN30菌株在振荡好氧条件下72h内对250mg/L苯胺的降解率为96.1%,DN425菌株的降解率为13.8%;在静置缺氧条件下AN30菌株的苯胺降解率为39.6%,DN425菌株的降解率仅为8.6%.DN425菌株在静置缺氧条件下4h内可将初始浓度为50 mg/L的偶氮染料酸性大红彻底脱色,而AN30菌株对酸性大红不具有脱色能力.以总DNA为模板,分别用tdnQ基因和fre基因特异性引物进行扩增,2株菌均能扩增出大小分别为380bp和630bp左右的目标条带,显示2菌株均携带有苯胺脱氨氧化酶基因和黄素还原酶基因.     

海水中原油对双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)的急性毒性效应及其体内抗氧化酶活性的影响

近年来海洋溢油事故频发,增加了溢油污染对海洋生物及海洋生态系统的暴露风险.为阐明海洋溢油事故对海洋生物的毒性效应,以双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）为受试生物,研究了不同质量浓度的海水原油溶液对双齿围沙蚕的急性毒性效应及抗氧化酶活性的影响.结果表明:双齿围沙蚕的死亡率与海水中原油暴露浓度呈正相关,暴露24、48及72 h的LC₅₀（半致死浓度）分别为13.08、9.80和8.37 g/L;暴露72 h后,双齿围沙蚕组织液中MDA（丙二醛）的含量均高于对照组,其中1.0 g/L暴露组显著高于对照组（P < 0.05）,且随暴露浓度的增大而升高;GST（谷胱甘肽巯基转移酶）的活性被显著诱导,且随暴露浓度的增大而升高;0.1 g/L原油暴露下,CAT（过氧化氢酶）和SOD（超氧化物歧化酶）的活性被显著诱导,当暴露浓度达到0.5 g/L时,CAT的诱导程度减弱,而SOD则受到抑制.研究显示,海水中的原油对双齿围沙蚕具有显著急性毒性效应,且0.1 g/L的原油暴露即可导致双齿围沙蚕产生脂质过氧化,脂质过氧化程度随暴露浓度的升高而增强;0.1 g/L原油暴露能显著诱导双齿围沙蚕体内抗氧化酶的活性,且随着海水中原油暴露浓度的增加,GST的诱导程度增强,CAT的诱导程度减弱,SOD的活性则受到抑制.