农田土壤抗生素抗性基因与微生物群落的关系

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)作为一种新型环境污染物,近20年来在农田土壤中广泛富集,促进了耐药性的传播.土壤微生物群落在农业种植下也发生了极大的变化,由于ARGs的传播扩散与微生物息息相关,因此关于两者之间关系及相互作用的研究急速增加.本文通过综述近几年的国内外研究成果,概述了农田土壤ARGs的分布现状和优势微生物群落的变化情况,从农业种植模式、有机肥施用情况、施用有机肥的种类、土壤理化性质和土壤污染影响等角度总结ARGs富集与优势微生物群落、微生物多样性变化的关系,指出耐药菌的变化情况,基于当下研究的不足展望了继续深入探索的方向,为今后进一步深入探索两者间的科学规律提出了设想.     

功能宏基因组学在新型抗生素耐药基因研究中的应用进展

抗生素耐药性是二十一世纪人类面对的最严峻的环境健康问题之一.抗生素耐药基因(Antibiotics resistance genes, ARGs)被认为是一类新型环境污染物.当前针对ARGs的主要研究方法有细菌分离和培养法、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、和宏基因组法.然而,仅有功能宏基因组方法能发现新型的ARGs.功能宏基因组方法利用新一代测序技术的高通量的特性,结合分子生物学技术和功能筛选构建有关抗生素耐药性的基因库,通过生物信息学分析高效地发现新型ARGs.本文综述了近来利用功能宏基因组技术筛选新型ARGs的相关研究进展,总结了功能宏基因学相关的技术和方法的优势和限制,并展望了功能宏基因学方法进一步发展的方向.     

牛粪发酵过程中抗生素耐药基因及相关菌群组成变化规律

随着规模化奶牛养殖迅速发展,牛粪带来的环境污染问题日益严重。实验探究牛粪及其堆肥过程中养分变化、抗生素耐药基因消减情况以及细菌群落演替规律,探讨细菌菌群与养分、抗生素耐药基因之间的相关性。采集牛粪及其堆肥过程样品,测定样品中养分、检测抗生素耐药基因相对丰度,采用16S r RNA高通量测序技术研究牛粪堆肥过程细菌群落变化。结果表明,从新鲜牛粪(组FM)到发酵牛粪(组C),样品中有机质含量下降,全氮和全磷含量有不同程度增加,全钾(TK)显著升高(P<0.05)。堆肥发酵后,抗生素耐药基因erm B、tet M、bla CTX-M和aac(6')-Ib-cr的相对丰度呈现不同程度的下降,而基因sul1相对丰度增加。高通量测序结果表明,在门水平,各组均以Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes这3个菌门为主,在属水平,各组具有不同的优势物种,其中发现Bacteroides、Paeniclostridium和Pseudomonas等7个潜在病原菌属的相对丰度在堆肥后有效降低。通过相关性分析发现,潜在病原菌属与基因tet M和sul1呈显著正相关(P<0.05),此外,大部分优势菌属与养分TK有显著相关性(P<0.05)。研究结果表明,牛粪经堆肥发酵后,病原菌相对丰度有效降低,抗生素耐药基因相对丰度的下降与细菌菌群结构变化存在相关关系。     

生态毒理学教学专栏寄语

抗生素的长期滥用,使得环境细菌耐药性不断增强,加速了耐药基因(antibiotics resistance genes,ARGs)在环境中的传播扩散,并给饮用水带来健康风险。在介绍饮用水中抗生素和耐药基因污染现状的基础上,阐述了耐药基因在饮用水中的来源和归趋,对环境中抗生素和耐药基因的人体健康风险做了初步探讨,针对目前饮用水的污染现状,对今后有关饮用水中细菌耐药的研究进行了展望。     

饮用水中细菌耐药及其健康风险研究进展

抗生素的长期滥用,使得环境细菌耐药性不断增强,加速了耐药基因(antibiotics resistance genes,ARGs)在环境中的传播扩散,并给饮用水带来健康风险。在介绍饮用水中抗生素和耐药基因污染现状的基础上,阐述了耐药基因在饮用水中的来源和归趋,对环境中抗生素和耐药基因的人体健康风险做了初步探讨,针对目前饮用水的污染现状,对今后有关饮用水中细菌耐药的研究进行了展望。     

水体中抗生素污染现状及其对氮转化过程的影响研究进展

近年来，抗生素引起的环境污染和生态风险备受关注.作为抗生素最重要的归宿地之一，自然水体中的抗生素污染日益加剧.逐渐累积的抗生素给水生生态系统带来风险，并会改变微生物群落的结构和功能，已成为水体中物质循环过程的重要影响因子.该文总结了我国河流和湖泊中抗生素的污染现状及其对水生生态系统产生的风险，综述了抗生素对水体中微生物群落以及硝化、反硝化和厌氧氨氧化等氮转化过程的影响.我国主要河流和湖泊中均有抗生素检出，类型包括磺胺类、四环素类、喹诺酮类和大环内酯类等，不同水体中抗生素的污染类型及浓度差异显著.目前，有关抗生素给水生生态系统造成的生态风险和对微生物群落的影响研究较多，而抗生素抗性基因在水环境中的传播扩散机制还需要更全面和深入的探索.抗生素可以通过改变氮循环功能微生物、酶活性和功能基因等影响水体中氮转化过程.对反硝化过程主要表现为抑制作用，对硝化过程的影响与其浓度和类型有关，而对厌氧氨氧化和硝酸盐异化还原为铵过程的影响研究相对匮乏.后续研究中还应探索水动力，盐度，水深和氧化还原梯度等典型水环境条件下，氮转化过程对抗生素的响应，为全面揭示抗生素对水体氮转化过程的影响提供依据.     

蛋鸡场中大肠杆菌对抗生素及消毒剂的耐药性

为了解蛋鸡场中抗生素、消毒剂的耐药情况,从蛋鸡场的环境(粪便、土壤、水体等)和鸡蛋中分离大肠杆菌,测定7种抗生素和2种季铵盐消毒剂对大肠杆菌的最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),检测18种抗生素耐药基因和5种季铵盐消毒剂耐药基因,并对大肠杆菌进行脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析.共得到44株大肠杆菌;大肠杆菌对抗生素耐药率为6.82%-90.91%,对土霉素(OTC)耐药率最高,对庆大霉素(CN)耐药率最低,所有大肠杆菌对头孢噻呋钠(CFS)表现敏感,一共产生14种不同的耐药谱型,其中,AMLTMP-OTC是最主要的谱型(N=10,P=23.81%);抗生素耐药基因检出率为2.27%-84.09%,tet C检出率最高,qnr A检出率最低.消毒剂苯扎氯铵(Benzalkonium chloride,BC)、氯化十六烷基吡啶(Cetylpyridinium chloride,CPC)对大肠杆菌的MIC范围分别为8-64μg/m L、4-256μg/m L,仅检测出qac EΔ1耐药基因(N=18,P=40.91%),qac EΔ1阳性大肠杆菌与甲氧苄啶(TMP)耐药表型存在显著相关性(P0.05);44株大肠杆菌PFGE基因型相似性在32.11%-96.62%之间.本研究表明蛋鸡场中大肠杆菌存在交叉传播的情况,对部分抗生素耐药性严重,同时对消毒剂出现耐药性,应引起足够重视.     

耐药菌的环境分布、传播及新型抗菌技术研究进展

抗生素的广泛使用导致细菌耐药性增加、多重耐药菌菌群数量急剧增多,严重威胁着人类生命健康.环境中耐药菌（ARB）及耐药基因（ARGs）的存在给临床治疗耐药菌感染带来了巨大挑战.有关医院中常见耐药致病菌的研究已有很多,尚缺乏环境中耐药菌的分布、传播及新型耐药菌抗菌技术等的相关研究.本文综述了耐药菌的环境分布特征及其传播机制,概述了新型抗菌技术及其应用,最后展望了有关环境耐药菌研究的未来发展方向.     

北运河水体浮游细菌群落的空间分布特征及其与水质的关系

污染源汇入和闸坝拦截等因素能够影响城市河流水生生态环境质量,主要表现在群落结构和功能的改变。分别于春季、夏季和冬季3个季节对北运河干流的10个点进行水样采集,通过16S rDNA末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析手段研究了北运河河道水体浮游细菌的群落结构,以揭示流域微生物多样性以及浮游细菌群落与水质因子的响应关系。共得到47种不同的片段,其中218bp片段是优势菌。T-RFs片段计算微生物多样性指数和均匀度指数结果表明,目前北运河水体生态结构已经较为脆弱。冬季与其他季节的群落组成有明显差别,夏季细菌丰度高于冬季。通过CANOCO软件分析浮游细菌群落结构与水质指标的空间特点,发现水体流动性降低、支流汇入和污染源的汇入都会引起微生物群落结构在空间上的改变;环境因子与微生物群落组成的相关性研究表明,总磷、溶解性有机碳(DOC)和温度对北运河微生物群落结构影响较大。     

水环境中耐热大肠菌群的抗生素耐药性与质粒谱研究

用滤膜法、mFC培养基从5种水体中分离出疑似耐热大肠菌162株,用API微生物分析系统鉴定到种,以Kirby-Bauer法分析其对人畜常用10种抗生素的耐药性,碱裂解法小量制备各菌株质粒DNA做质粒谱分析.结果表明,埃希氏大肠杆菌为优势菌,占分离菌总数的96.3%.除分离自泉水的3株外,其它菌株都对3种及3种以上抗生素耐药,多重耐药率为98.1%.不同水体分离菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素的耐药率有显著性差异(P<0.005).92株菌(56.8%)提取到大小为0.90～158.83kb、数量为1～6个的质粒,有81种质粒谱型.70株(43.2%)未提取到质粒的细菌中有67株为多重耐药.具有相同质粒谱型的菌株耐药谱都不相同.未发现质粒谱与抗生素耐药性间有明显相关性.图1表3参15     

府河水体及沉积物细菌群落结构分布特征及其影响因素

城市河流承接不同类型的废水导致水质恶化,影响河流生态系统.通过分析河流细菌群落结构变化,不仅可以判断河流污染特征,还将有助于河流污染治理与生态修复.笔者研究了府河夏季上下游水体和沉积物理化性质,并采用高通量测序法分析了细菌群落结构特征.结果 表明,府河上游水质化学需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)和总磷(TP)浓度显著高于下游(P＜0.05),沉积物中重金属镉、锌和铅含量较高,均值分别为(0.44±0.03)、(182.17 ±0.34)和(35.76±0.20) mg· kg-1.府河沉积物细菌多样性及丰富度明显高于相应上覆水体,变形菌门(Proteobacteria)是水体和沉积物中的第一优势菌,水体中参与氮循环的蓝藻菌门(Cyanobacteria)的高丰度说明府河存在一定的富营养化,此外,可以分解有机物的放线菌门(Actinobacteria)在下游丰度高于上游;沉积物中具有致病作用的拟杆菌门(Bacteroidetes)在上游城市河段丰度较高.细菌群落空间异质性结果表明下游硝化细菌(nitrifying bacteria)和反硝化细菌(denitrifying bacteria)的丰度(分别为62.25％和31.29％)明显比上游高.水体细菌多样性和温度、pH、总有机碳有显著相关性(P＜0.05),冗余分析显示NH3-N、总氮(TN)、TP和pH对细菌群落结构影响较大;而pH、TN和重金属镉是影响下游沉积物细菌群落结构的主要环境因子.     

农村固体废弃物中抗生素及耐药基因的赋存及风险管理

全球范围内抗生素抗性的传播扩散严重威胁人类健康。固体废弃物中的生活垃圾、污泥和畜禽粪便是抗生素及耐药基因的重要储库。针对新型环境污染物抗生素和耐药基因,综述了农村固废中抗生素及耐药基因的赋存和传播扩散,阐述了农村固废中抗生素及细菌耐药的生态风险、控制管理和消除方法,并结合目前抗生素及耐药基因的污染状况,对今后研究重点进行了展望。     

淡水环境中抗生素抗性基因的来源、归趋和风险

近年来淡水体中抗生素耐药菌及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的广泛分布和快速传播已成为全球性的环境健康热点问题,国内外学者围绕淡水环境中ARGs的主要来源、多介质分布、转移机制及ARGs与微生物群落的互作机制开展了一系列研究.本文综述了医疗废水、污水处理厂尾水和养殖废水作为淡水环境中ARGs主要来源的关键作用,分析了国内外淡水环境中ARGs多介质分布和归趋特征,阐明了淡水环境中ARGs传播扩散途径和归趋影响因子,归纳了ARGs风险形成机制与评价方法,提出了未来关于淡水环境中ARGs的研究热点和趋势,以期为ARGs环境与健康风险管控提供参考.目前关于ARGs产生过程与归趋特性的认识仍相对局限,ARGs在水生食物链中动态归趋特征、传播扩散过程和暴露风险形成机制的相关研究亟待加强,淡水环境ARGs生态健康风险的系统评估方法也需尽快建立.     

北江河水中抗生素抗性基因污染初步研究（Preliminary Studies on the Pollution Levels of Antibiotic Resistance Genes in the Water of Beijiang River, South China）

环境中细菌的耐药性,尤其是对抗生素的耐药性已成为影响生态环境的重要因素.论文采用抗生素抗性平板法调查了北江河水中四环素、红霉素及磺胺类这3类抗生素耐药性细菌的存在,采用定性PCR及荧光定量PCR方法分别研究了该水域sul1和sul2这2种磺胺类抗生素抗性基因(ARGs)的存在和含量水平.结果表明,所采集北江水域的9个样品中有5个对四环素有耐药性,7个对红霉素有耐药性,8个对磺胺二甲嘧啶有耐药性;定性PCR实验并经基因测序结果证实,5个样品含有sul1,4个样品含有sul2.进一步的PCR定量分析结果显示,7个样品中均检出sul1和sul2磺胺抗性基因,它们与内对照基因16S-rRNA表达量比值分别在10-2.56~10-0.52及10-3.25~10-1.24范围内,该结果显著高于美国科罗拉多州北部河流的研究结果.此外,数据分析也发现,sul1和sul2磺胺抗性基因的含量水平与该区域水中磺胺含量分布具有一定的相关性,表明外源性抗生素对河流的污染是诱导抗性基因的重要因素.     

厦门后溪流域沿城乡梯度浮游细菌多样性及其与环境因子的关系

为研究城市化对河流浮游细菌的影响,选取厦门后溪流域沿城乡梯度采集样品,并利用变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和多元统计方法对浮游细菌群落空间分布格局进行分析.结果表明,Shannon-Weiner多样性指数和DGGE条带数随着采样站点和城市中心距离的减小呈现先升高后下降的趋势.聚类分析(Cluster)和多维尺度分析(Multidimensional scaling,MDS)将12个站点的浮游细菌群落分为4组,测序结果显示β-变形菌(Betaproteobacteria)是优势类群,占40.0%.统计分析表明,pH和总氮(Total nitrogen,TN)是影响后溪浮游细菌群落组成最主要的环境因子,他们共同解释了47.6%的群落组成变化.总之,沿城乡梯度随着水体理化指标的变化,浮游细菌群落也发生明显转变,表明后溪浮游细菌受到城市化的强烈影响.此外,结果也提示DGGE可以作为监测与评价河流生态系统健康的重要工具.图6表2参33     

中国边缘海沉积物中抗生素抗性基因和致病菌的组成特征

抗生素抗性基因作为一种新型“污染物”已经受到广泛关注.研究边缘海中抗生素抗性基因和人类致病菌的组成特征,有助于深入认识海洋环境中抗生素抗性基因的起源和海洋致病菌的潜在健康风险.使用基于高通量测序的宏基因组学分析方法在中国边缘海沉积物中发现了多种抗生素抗性基因,主要以多重耐药基因为主,其中南海沉积物中抗生素抗性基因的总丰度约是黄渤海的2倍.与中国边缘海相比,珠江口沉积物中抗生素抗性基因丰度更高,与人类常用抗生素（如磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类等）的耐药性更为相关.此外,中国边缘海沉积物中几乎没有发现质粒携带的抗性基因,而珠江口有约20%的抗性基因由质粒携带.中国边缘海沉积物中主要人类致病菌种包括肺炎链球菌（24.4%）、肺炎克雷伯菌（19.9%）、无乳链球菌（9.2%）、铜绿假单胞菌（6.9%）等.珠江口沉积物中致病菌群落组成与中国边缘海显著不同,副溶血性弧菌和空肠弯曲杆菌的丰度相对更高.上述研究表明,中国边缘海沉积物中存在高多样性的抗生素抗性基因和人类致病菌,人类活动干扰可导致其污染水平提高.     

畜禽养殖场附近污水中多粘菌素E耐药性肠杆菌的分离分析及内源质粒检测

畜禽养殖业大量使用抗生素引起了广泛的微生物耐药性问题,研究抗生素耐药菌株可以了解环境中细菌的耐药性情况和抗性基因的传播机制。采集畜禽养殖场周边的污水,分析了污水中多粘菌素E耐药性细菌和耐药性肠杆菌的丰度;同时以一株具有较高多粘菌素E耐药水平的肠杆菌R11为例,首先进行16S r DNA测序和抗生素耐药谱分析,然后通过质粒提取、酶切电泳以及脉冲场凝胶电泳(PFGE),分析其内源性质粒等情况。结果表明:在畜禽养殖场周边污水环境中,多粘菌素E耐药性细菌占细菌总数的0.14%~0.35%,多粘菌素E耐药性肠杆菌占肠杆菌总数的1.50%~7.40%,而肠杆菌占细菌总数的1.13%~2.45%,说明肠杆菌可能是携带多粘菌素E抗性基因的主要细菌种类,同时也是养殖业污水中细菌的主要组成部分。16S r DNA序列分析确定R11是一株Enterobacter cloacae,抗生素耐药谱分析R11具有多重耐药性,除对林可霉素敏感外,阿米卡星、四环素和环丙沙星的最小抑菌浓度(MICs)为10μg?m L~(-1),阿莫西林的MICs为25μg?m L~(-1),磺胺甲恶唑的MICs为32μg?m L~(-1),氨苄西林的MICs为40μg?m L~(-1),链霉素的MICs为90μg?m L~(-1),而多粘菌素E的MICs最高,达到96μg?m L~(-1)。质粒提取酶切和PFGE分离鉴定结果显示,R11菌株可能有多个内源性质粒。综上所述,R11菌株具有较高水平的多粘菌素E耐药性,并且具有多重耐药性和多个内源性质粒,对于研究多粘菌素E耐药性机制具有一定的参考价值。     

富营养化太湖沉积物中微生物群落及对环境因子的响应

沉积物是水生态系统重要的组成部分,研究沉积物中的微生物多样性及群落结构有助于从侧面了解水体的水质状况.采集太湖中具有不同富营养化水平的梅梁湾(ML)与湖心区(HX)表层沉积物(0--2 cm),测定沉积物样品中的总有机碳(TOC)、总氮(TN)、无机氮(NH4+-N与NO3--N)、pH、氧化还原电位(Eh)与溶解氧(DO),利用基于16S rRNA基因的Illumina Miseq宏基因组测序技术研究沉积物样品中的微生物群落结构,并分析沉积物中微生物群落结构与环境因子的潜在关系.从太湖两处采样点6个沉积物样品中共获得234 408条有效序列,Sobs指数在1 811-2 442之间,Shannon指数在6.16-6.49之间,Coverage值在96.2%-97.7%之间,说明序列信息量足够大且微生物多样性较高.沉积物中细菌相对丰度为99%以上,共检测到48个门118个纲.其中变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,在ML和HX沉积物中的相对丰度分别为40.5%和35.4%,主要包括δ-proteobacteria和β-proteobacteria纲.其他较为丰富的门类包括绿弯菌门(Chloroflexi)、硝化螺菌门(Nitrospirae)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等.将沉积物中纲水平微生物群落组成与理化因子进行Spearman相关分析可知,Eh、DO、pH、NH4+-N和TOC含量能显著影响纲水平优势微生物类群(OTU1%),且以Eh影响的微生物类群种类最多.上述研究表明,太湖沉积物中微生物资源丰富,不同富营养湖区理化因子是影响其中微生物群落结构的重要因素.(图4表3参42)     

基于宏基因组学的三峡库区重庆主城段水体浮游微生物群落的组成和功能分析

三峡水库建成以来,水生环境发生了显著的变化,水库浮游微生物在关键生源要素循环中发挥关键驱动作用。为了分析三峡库区重庆段水体浮游微生物的功能及多样性,于2015年5月对三峡库区重庆主城段(北碚、朱沱、木洞)表层水环境总DNA样本进行了提取。调查水域总磷(total phosphorus,TP)、总氮(total nitrogen,TN)已分别达到IV、V类水标准,水体污染主要是由TN,TP造成的,各调查水域均处于中营养至重富营养状态。基于宏基因组学技术在Illumina HiSeq 4000平台上对总的浮游微生物进行了序列测定,分析了重庆主城段水环境浮游微生物的物种以及功能结构特征。结果显示,朱沱和木洞点位水体优势门为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。北碚点位水体优势门为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌门(Cyanobacteria)。在属水平上,颤藻属(Oscillatoria)和微鞘藻属(Microcoleus)只出现在北碚点位的嘉陵江表层水体,其余两处几乎没有。在对3组样本一共99 472条基因进行通路分析时,有54 340条有功能注释结果。由直系同源聚类(cluster of orthologous group,COG)注释结果得知,浮游微生物物种基因的主要功能为翻译、核糖体结构和生物合成、氨基酸转运和代谢。Pearson相关分析结果显示:水温(T)、总碳(total carbon,TC)、溶解有机碳(dissolved organic carbon,DOC)是影响三峡库区重庆段浮游微生物群落结构的重要环境因子。     

机舱空气环境耐药基因及耐药细菌的污染特征研究

研究表明飞机旅行是传染病在世界范围内传播的主要途径之一。由于飞机机舱内的密闭性,具有乘客密度大、污染物负荷大、新风量小等特点,使机舱成为极易传播疾病的场所。为了探究机舱环境中耐药细菌和耐药基因的分布情况,选择一架国际航线空客A320机舱内高效空气过滤器滤膜颗粒物作为研究对象。结果显示,在该空客机舱滤膜上31种耐药基因的检出频率为83.9%。Ⅰ类整合子基因的相对含量高于所有耐药基因,为3.94×10-1(基因拷贝数/16S rRNA拷贝数)。β内酰胺类耐药基因的相对含量在1.51×10-5～1.26×10-2之间。3种磺胺类耐药基因的相对含量都相对较高,sul2的含量最高,为4.81×10-2。Ⅰ类整合子介导的耐药基因水平转移可能是机舱内耐药基因传播扩散的主要机制之一。此外,对分离出的64株细菌进行耐药表型检测发现,具有磺胺甲恶唑耐受性的细菌为50株(78.1%),具有庆大霉素耐受性的细菌为41株(64.1%),具有亚胺培南耐受性的细菌为24株(37.5%)。其中61株菌至少含有两重耐药性,只有4株芽孢杆菌对四环素具有耐药性。样本中分离出很多条件致病菌,比如阴沟肠杆菌和蜡样芽胞杆菌等,这对乘客和机组人员的安全造成直接危胁。上述研究结果表明机舱环境成为耐药基因跨境传播的重要途经。