响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析

短小芽孢杆菌SCU11是由本实验室分离的野生菌株BA06经过复合诱变得到的高产碱性蛋白酶菌株,其产生的碱性蛋白酶在生物制革领域具有很好的应用前景.为进一步提高菌株的蛋白酶产量以满足工业生产的需求,本研究利用响应面法优化菌株产蛋白酶的发酵培养条件.在前期单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、中心组合实验设计和响应面分析法,确定了当黄豆粉浓度为53.3 g/L,温度为28℃时,蛋白酶活有理论最大值8 884 U/m L,摇瓶实验验证酶活为8 768 U/m L,达到理论预测值的98.7%,比优化前酶活提高了1倍.为了解优化的发酵条件使蛋白酶产量提高的原因,对短小芽孢杆菌蛋白酶基因及相关调控基因的表达情况进行荧光定量PCR分析,结果显示,优化后5种蛋白酶基因的表达量上调,1种表达量下调;5种蛋白酶相关调控基因的表达量增加,2种基因表达量降低.推测是优化后正调控基因表达量的增加以及负调控基因表达量的降低,促进了短小芽孢杆菌胞外蛋白酶基因转录水平的提高,导致胞外蛋白酶产量增加.本研究采用响应面法优化发酵条件使短小芽孢杆菌SCU11蛋白酶产量提高了1倍,并为阐明其表达调控机制奠定了基础.(图3表7参24)     

两株芽孢杆菌降解羽毛比较及抗氧化肽分离

枯草芽孢杆菌UMU4和短小芽孢杆菌SCU11是四川省分子生物学及生物技术重点实验室分离的野生菌株经诱变获得的胞外蛋白酶高产菌株,其分泌的蛋白酶在蛋白废弃物处理方面具有良好的应用前景.为了从这两株芽孢杆菌中筛选出高效利用羽毛的最优菌株,将UMU4和SCU11分别接种到羽毛培养基中并持续发酵6 d,通过每天测试羽毛降解率、可溶性多肽含量、氨基酸含量、蛋白酶活及抗氧化活性等指标来评价这两株菌对羽毛的降解能力.结果发现SCU11能更高效地利用羽毛,其羽毛降解率是UMU4的1.2倍,第5天时约有65%的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸;SCU11发酵液的ABTS自由基清除率和还原力均在第3天达到最大值,且显著高于UMU4羽毛发酵液的抗氧化活性;SCU11在第5天所产角蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别是UMU4的1.6和1.2倍.在此基础上,将来自于SCU11的羽毛降解产物经HCl沉淀和疏水层析获得了4个抗氧化肽组分,其中组分F3的抗氧化活性最高.本研究表明芽孢杆菌SCU11较之UMU4具有更高的产酶活性及更强的羽毛降解能力,结果可为家禽羽毛的资源化应用奠定基础.     

一株产胞外多糖的山药内生细菌Lysinibacillus fusiformis S-1的分离和鉴定

微生物的胞外多糖是重要的生物资源,为获得新型的具有药用价值的胞外多糖产生菌,从山药、地瓜、马铃薯和胡萝卜的根茎组织中分离、筛选到11株能产胞外多糖的植物内生菌,利用苯酚–硫酸法对这11株菌的多糖产量进行了定量分析.对多糖产量最高的S-1菌株,检测其在发酵过程中菌体生长、胞外多糖生成以及发酵过程的pH变化,绘制其胞外多糖发酵代谢曲线.通过形态观察、培养特性观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定.结果显示,S-1菌株在产糖培养基中可以产生1.50 g/L的胞外多糖,在11株菌中产量最高.16S rDNA序列分析显示该菌属于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus),且与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(L.fusiformis)亲缘最近.综合其形态特征、培养特性和生理生化实验结果,将S-1菌株鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌.该菌在胞外多糖产生菌中少有报道,为胞外多糖的进一步研究提供了菌种资源.     

枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用

从小麦根际土壤中分离到一株对多种植物病原真菌有拮抗作用且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis T2.经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,获得具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株.与出发菌株相比,培养48 h的正突变株胞外蛋白酶活力提高108.5%,负突变株蛋白酶活力降低81.1%,而二者的几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均无显著变化.正突变株对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum)的平板拮抗作用增强,其粗酶液可使该菌菌丝变形膨大成珠状、原生质浓缩,萌发的孢子芽管短且畸形膨大;负突变株对该菌的平板拮抗作用显著降低,粗酶液对该菌菌丝和孢子的形态无明显作用.表明提高生防芽孢杆菌胞外蛋白酶的活力可增强其拮抗病原真菌的能力.     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

生防枯草芽孢杆菌胞外植酸酶对小麦耐盐性的影响

以产植酸酶的广谱拮抗生防枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变,得到遗传特性稳定的一株植酸酶负突变株M3.采用有效磷限量、含NaCl 150 mmol L-1的植物生长水培液对小麦进行盐胁迫,在植酸存在的条件下,水培液中施加T2发酵液或植酸酶均可促进盐胁迫下小麦幼苗的生长,小麦株高、鲜重、叶片叶绿素含量和根系活力均得以增高,而植株丙二醛(MDA)含量降低.失去植酸酶活力的负突变株M3发酵液则不具有提高小麦株高鲜重和叶绿素含量的作用,对根系活力的提高和对MDA含量的降低程度也均低于T2发酵液处理.上述结果表明,生防枯草芽孢杆菌胞外植酸酶在增强小麦耐盐性方面起了重要作用.图6表2参13     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的随机突变

碱性蛋白酶(DHAP)属于丝氨酸蛋白酶家族(S8A),是由275个氨基酸残基组成的单链多肽,没有二硫键,以Asp32、His64、Ser221作为活性中心.采用易错PCR方法,对短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(GenBank登录号:AY458140)进行随机突变.在大肠杆菌中建立随机突变文库,然后转化枯草芽孢杆菌WB600,构建枯草芽孢杆菌突变文库,筛选出酶活性提高或最适反应温度和pH值有所降低的突变体.通过3轮的随机突变和筛选,获得2个阳性突变体pP43AP-M166和pP43AP-M375.其中pP43AP-M166在不同的温度和pH条件下,与出发菌株相比,酶活都有不同程度提高,特别是当反应温度为50℃、pH为10时,突变蛋白酶酶活性提高1.23倍,表现出很好的热稳定性.测序结果表明,该突变体含有一个氨基酸置换,位于碱性蛋白酶催化三联体活性中心His64旁,与其只有一个氨基酸残基相隔.     

编码水稻胞外核苷酸双磷酸酶基因的表达特性

NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物巾分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉日的.在盐胁迫条件下,TO代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.图7表3参20     

温敏核不育水稻双低-S单胞期花药蛋白质的固相双向电泳分析

对温敏感核不育水稻双低-S不同温度下的单胞期花药蛋白质进行固相双向电泳分离,经银染后,获得了清晰而稳定的图谱。以300ug左右的蛋白质进行电泳,分离开的蛋白点(多肽)可超过500个.在32℃温度下的花药蛋白点要比19℃温度下多,其中蛋白质点(MW14KD,pI5.4)在19℃可育条件时稳定出现。32℃不育条件时却缺失;而蛋白质点(pI7.6)和蛋白质点(pI7.8)非常明显的在不育条件下出现,而在可育条件下缺失。     

DacD过量表达对大肠杆菌胞外蛋白生产的影响

大肠杆菌(Escherichia coli)是广泛用于重组蛋白表达的宿主之一,但缺乏高效的蛋白胞外分泌机制,为提高其胞外蛋白生产水平,分析D,D-羧肽酶DacD过量表达对E. coli胞外蛋白生产水平的影响.结果表明,与对照株相比,过量表达DacD时重组E. coli BL21(DE3)的重组绿色荧光蛋白(GFP)的胞外生产水平提高了1.6倍.同时,当过量表达DacD时,E. coli BL21的重组淀粉酶胞外生产水平较对照株提高了2.6倍.进一步研究发现,DacD的过量表达可促进E.coli BL21细胞内可溶性肽聚糖的积累.过量表达DacD也增强了E. coli BL21细胞内膜的通透性. DacD过量表达导致了E.coli BL21细胞形态的变化,重组菌株细胞两端形成了透明的球状囊泡结构.因此,通过过量DacD提高E. coli胞外蛋白生产水平是可行的.     

外源活性污泥胞外聚合物对小球衣藻聚集行为的影响

微藻聚集行为在藻华的治理等方面具有重要作用,也是目前微藻生物燃料收集的瓶颈之一.以小球衣藻为研究对象,观察污泥胞外聚合物(Extracellular polymeric substance,EPS)对微藻聚集行为的影响,并通过其聚集数据采集、EPS客观特性和微藻的自身响应等方面探究其可能的聚集原因.结果显示:随着外源性污泥EPS浓度的增大,小球衣藻聚集率从18.4%上升到81.8%,并且在110 mg/L时达到聚集率最大值.微藻细胞运动速度从26.8μm/s上升到49.4μm/s,增大了细胞间的碰撞几率,促进了微藻的聚集.三维荧光光谱表明,污泥胞外聚合物刺激了微藻色氨酸类蛋白和芳香族类蛋白的分泌,其分泌量与EPS的浓度成正比.但是外源性EPS溶液Zeta电位变化与微藻的聚集率呈负相关关系,并非微藻聚集原因.本研究表明外源性污泥胞外聚合物能够促进微藻的聚集,结果可为下一步在分子方面的探究提供实验基础.(图7表3参38)     

有机底物对活性污泥胞外聚合物的影响

研究了城市污水中常见的具有不同特性的有机底物(蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠,以及乙酸钠和葡萄糖的混合物)分别在四个相同的反应器中所培养的活性污泥胞外聚合物的量和组成．结果表明：有机底物的特性影响胞外聚合物的组成和量,在乙酸钠为底物的污泥中,胞外多糖占大部分(糖类／蛋白质的比值为1．7—8.6,质量比),而以蛋白胨为底物时,胞外蛋白质占主要成分(糖类／蛋白质的比值为0.2-0.5);以乙酸钠为底物形成的胞外聚合物的总量较多,通过扫描电子显微镜和原子力显微镜对活性污泥进行观测,确证了胞外聚合物的存在及其形式,并得到了胞外聚合物层的大致尺寸．     

胞外呼吸菌Exiguobacterium sp. PY14的分离鉴定及其异化铁还原特性

胞外呼吸菌广泛分布于自然生境中,是驱动铁等元素地球化学循环的重要因素,已成为各种有机污染物降解和重金属污染去除的研究热点.为了挖掘具有环境修复应用前景的胞外呼吸菌,从鄱阳湖湿地土壤中筛选具有胞外异化铁还原能力的菌株,通过形态、生理生化和遗传分析进行菌种鉴定,并对其最优生长条件、异化铁还原特性及胞外电子传递机制进行研究.结果显示,分离得到的菌株PY14具有较高的异化铁还原能力,细菌形态、生理生化特征及16S rRNA基因系统发育分析鉴定其为革兰氏阳性的微小杆菌属（Exiguobacterium）;具有嗜碱耐盐生长特性,最适生长pH值为8.0,在NaCl浓度高达50g/L条件下生长良好;能够利用葡萄糖、丙酮酸、乙酸和乳酸等多种小分子碳源（电子供体）进行厌氧呼吸,5 d内5 mmol/L水铁矿的还原率高达80%,添加电子穿梭（蒽醌-2,6-二磺酸盐）可显著增强其异化还原水铁矿、针铁矿和赤铁矿的速率;可通过自身分泌腐殖酸类电子穿梭体实现介导异化铁还原过程.本研究获得了一株有望在盐碱土壤或水体等环境中高效驱动铁还原的胞外呼吸菌,为进一步认识革兰氏阳性细菌胞外电子传递机制提供新依据.（图8表1参4...     

甲基营养型芽孢杆菌的分离鉴定及在防蝇产蛆环境防治中的应用

从华南农业大学试验基地土壤筛选芽孢杆菌,得到17株芽孢杆菌,结合插入序列指纹图谱对分离获得的芽孢杆菌进行聚类分析,共分为3个类群;测定各类群代表菌株的16S rDNA序列,分析其系统发育,结果表明类群Ⅰ代表菌株RF2与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus CBMB 205~T)相似性为99.48%;类群Ⅱ代表菌株RF10与好氧芽孢杆菌(Bacillus aerophilus 28K~T)相似性为99.61%;类群Ⅲ代表菌株RF16与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC14579~T)相似性为99.87%.餐厨垃圾试验表明类群Ⅰ RF2具有餐厨垃圾防蝇产蛆效果;并且生理生化、碳源利用以及抗菌谱试验表明菌株RF2在碱性条件下可以将葡萄糖分解成丙酮酸并脱羧氧化生成二乙酰,既能够将氨转化为氨基酸和胞内其他含氮化合物,也利用多种碳源供自身生长,能够拮抗多种植物病原菌(水稻纹枯病、尖刀廉孢菌、香蕉枯萎病).而RF2在含有难溶性的磷酸盐[Ca_3(PO_4)_2]条件下可分泌出有机酸降低pH值,使难溶性磷酸盐溶解供自身利用.因此本研究获得的菌株RF2是一株具有较强促生作用和应用于防蝇产蛆的芽孢杆菌,具有很好的应用前景.     

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.图5表2参18     

活性污泥胞外聚合物的分层组分及溶解性微生物代谢产物的特性

提取了活性污泥胞外聚合物(EPS)和溶解性微生物代谢产物(SMP),并按EPS的紧密程度对松散EPS、紧密EPS的分层组分以及SMP属性进行了分析鉴定.结果表明,以葡萄糖为基质时,松散EPS的主要组成是多糖,紧密EPS的主要组成是蛋白质,而SMP主要由腐殖质类物质构成.SMP、松散EPS、紧密EPS和总样EPS的三维荧光图谱显示其只有类色氨酸峰和类腐殖酸峰,其类腐殖酸峰主要是由生物代谢产生的腐殖质组成.大分子量腐殖质类物质在几种组分中均出现,但是具有腐殖质特性的分子量为8500 Da的组分会在SMP中大量生成,而具有腐殖质特性的分子量为400 Da的组分只存在于EPS的紧密层中,这与微生物对这3种物质的生物可利用性有关.     

用三维荧光和红外技术分析好氧颗粒污泥形成初期胞外聚合物的变化

为了研究聚合氯化铝(PAC)的投加在好氧颗粒污泥培养初期的作用,本研究分别在污泥培养的第1—7天(R1)和第8—14天(R2)投加PAC,并采用三维荧光光谱(3D-EEM)和傅立叶红外光谱(FTIR)技术分析好氧颗粒污泥形成初期胞外聚合物(EPS)各组分的含量及变化规律.结果表明,PAC投加时间推迟后,污泥沉降性能良好,且反应器中胞外聚合物和蛋白质含量明显增多,松散附着的EPS(LB-EPS)中蛋白含量变化趋势明显,多糖含量保持在较小范围内波动,与溶解性胞外聚合物(S-EPS)和紧密黏附的胞外聚合物(TB-EPS)相比较,LB-EPS和污泥颗粒化有密切关系;三维荧光光谱分析结果显示,R2中荧光类蛋白物质(峰A和峰B)强度均大于R1,而腐殖酸类物质(峰C)强度小于R1,说明A和B这两种荧光类蛋白物质在微生物聚集体形成过程中的作用更加重要;红外光谱表明,1636 cm-1、1654 cm-1分别属于蛋白质二级结构中C=O伸长振动引起的,分别存在于S-EPS和LB-EPS、TB-EPS中,且在投加PAC的时间推迟后1654 cm-1处的吸收峰吸收较弱,和三维荧光分析共同表明LB-EPS中的蛋白类物质是好氧颗粒污泥形成初期加入PAC进行强化造粒的核心原因之一.     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质

对鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化方法及其性质进行了研究 .其中 ,蛋白酶的纯化步骤包括 :(1)硫酸铵沉淀 ;(2 )SephadexG 10 0凝胶过滤 ;(3)DEAE Sepharose色谱分离 ;(4)DEAE Cellulose (DE 32 )色谱分离 .经上述纯化步骤得到两种蛋白酶 ,经SDS PAGE分析 ,Mr分别为 37.4× 10 3 和 33.1× 10 3 .以偶氮酪蛋白 (azocasein)作底物测其水解酶活性 ,结果表明二者差别显著 ,前者明显高于后者 .而且 ,Mr37.4× 10 3 的蛋白酶在pH 7～ 10范围内均显示较高活性 ,在 4 0～ 6 0℃范围内稳定性好 .结果表明该蛋白酶是一种金属蛋白酶 .关于该蛋白酶对牙鲆(Paralichtysolivaceus)的毒性作用尚在研究之中 .图 6表 3参 17     

不同方法对甘薯块根可溶性蛋白的提取效果

为建立一套适宜甘薯块根蛋白质组学分析的双向电泳体系(2-DE),采用匀浆法、丙酮沉淀法、TCA-丙酮沉淀法和酚提取法来制备甘薯块根可溶性总蛋白,并分别通过蛋白质定量、SDS-PAGE和2-DE技术来评估这4种蛋白制备方法提取甘薯块根蛋白质的优劣.结果显示,每0.5 g鲜薯块根,经Bradford方法测定蛋白质的得率分别为1.6 mg、2.4mg、1.2 mg、1.9 mg.SDS-PAGE的结果表明,匀浆法、丙酮法制备的蛋白质分离到的条带较少,且在约M r20×103处的储藏蛋白含量较高;TCA-丙酮法和酚提取法制备的蛋白质分离到的条带则明显多于前两种方法,且M r20×103处储藏蛋白的相对含量也明显减少.2-DE结果显示,匀浆法制备的蛋白质在进行双向电泳分析时,几乎不能完成聚焦过程,仅在凝胶的碱性端出现少量的蛋白质斑点,丙酮法和TCA-丙酮法要优于匀浆法,但是蛋白质斑点数量仍然较少,酚提取法提取的蛋白质在进行双向电泳时分离到的蛋白质斑点数最多,为1 120个,且在凝胶上均匀分布,背景清晰.综上所述,酚提取法是适宜甘薯块根蛋白质双向电泳样品制备的最佳方法.     

城市污水生物处理过程中结合型和游离型胞外抗生素抗性基因的产生特征

胞外抗生素抗性基因是抗性基因的重要存在形式,可能通过转化重新进入细胞表达抗药性.因此其具有严峻却隐蔽的健康风险,且不同形态胞外抗生素抗性基因的风险存在显著差异,然而当前针对胞外抗性基因风险的研究极为稀少.本研究以序批式活性污泥反应器(SBR)为例,考察了污水生物处理过程中结合型和游离型胞外抗性基因产生的时空特征,以及曝气强度和污泥负荷的影响.结果 表明,SBR启动期2种胞外抗性基因均大量产生,且游离型胞外抗性基因的增加倍数和持续时间高于结合型:稳定运行后2种胞外抗性基因的丰度显著下降.从胞内外抗性基因的比重来看,好氧阶段以胞外抗性基因为主,且游离型胞外抗性基因比例达60％以上;厌氧阶段以胞内抗性基因为主,且结合型胞外抗性基因比例升高(7.5％～31.9％);出水中游离型胞外抗性基因占据绝对优势,比例达66.5％ ～ 86.9％.曝气强度提高使2种胞外抗性基因丰度显著提高,但游离型胞外抗性基因提高程度(2.2倍～12.2倍)高于结合型(2.1倍～62倍).污泥负荷提高同样导致2种胞外抗性基因丰度提高,但游离型胞外抗性基因提高程度(1.3倍～7.8倍)低于结合型(1.9倍～ 13.3倍).研究表明,大量胞外抗性基因将在污水生物处理过程中产生,并随污水排放至环境中,是水环境中抗生素抗性基因(ARGs)的重要来源之一.