龙眼胚性愈伤组织维生素C过氧化物酶基因(apx)及NADH脱氢酶基因(nad2)部分序列的克隆

采用PCR技术从龙眼胚性愈伤组织中扩增出维生素C过氧化物酶基因 (apx)的部分cDNA序列longan1及NADH脱氢酶基因(nad2)的部分cDNA序列longan31,其中longan31是首次从体胚中克隆到的NADH脱氢酶基因(nad2).杂交结果显示,longan1与胚性愈伤组织和球形胚的RNA具有明显杂交信号,说明longan1在胚性愈伤组织和球形胚阶段特异表达. 图 3参 19     

龙眼Hsf基因家族全基因组鉴定及体胚发生过程中的表达分析

基于龙眼基因组数据库对龙眼Hsf(DlHsf)基因家族进行全基因组鉴定,并对其基因结构、启动子作用元件和CpG岛分布情况、编码蛋白的理化性质和进化情况以及它们在不同体胚发生阶段和不同组织器官的表达情况进行研究,同时对靶定DlHsf的miRNA进行预测分析.结果表明:DlHsf基因家族共20个成员,基因结构高度保守.它们编码的蛋白具有典型的DNA结合域(DBD),且均为不含信号肽的不稳定蛋白.启动子分析发现,该基因家族成员的启动子除典型的热激元件(HSE)外,还含有MYB元件等与逆境胁迫及生长发育相关的元件,DlHsfA1d、DlHsfA9a、DlHsfA9b和DlHsfC1启动子存在典型的CpG岛.进化树分析表明DlHsf可分为DlHsfA、DlHsfB和DlHsfC三类. qRT-PCR结果表明,DlHsf在胚性阶段(EC)和球形胚阶段(GE)表达量较高,在不完全胚性紧实结构阶段(ICpEC)表达量较低,在龙眼体胚发育过程中呈现"V"状趋势,表明DlHsf可能主要在EC、GE阶段发挥作用.此外,DlHsf家族成员在花芽和花蕾中表达量较高,其次是在果肉中,推测DlHsfs可能与龙眼花发育等生长过程相关. psRNA Target预测结果表明DlHsf基因家族受到miRNA调控,且调控方式多样.本研究表明DlHsf功能多样,可能在龙眼生长发育、胁迫响应、DNA甲基化、组织器官特异表达等生物学过程中发挥作用.(图8表5参38)     

龙眼胚性细胞悬浮培养再生植株

以龙眼胚性愈伤组织为起始材料 ,研究了胚性悬浮细胞培养的影响因素、继代保持方法及其体胚发生与植株再生 .结果表明 ,建立龙眼优良胚性悬浮细胞系的技术关键在于 :由松散型胚性愈伤组织作为起始材料 ;以去除琼脂的保持松散型胚性愈伤组织的培养基作为启动培养基 ;采用分别附加 5mgL-1AgNO3 、10 0mgL-1肌醇的培养基交替继代保持 .胚性悬浮细胞在附加 2 %蔗糖、0 .7%琼脂、4 0 0mgL-1LH、10 0mgL-1肌醇的MS固体培养基上形成的体胚数量可达 7× 10 4～ 14× 10 4g-1.经过成熟培养后 ,体胚转换植株的频率在 6 5 %以上 .图版 1图 1表 3参 16     

龙眼miR156家族及其调控靶标SPL的生物信息学和表达模式

为了解miR156基因家族的进化特性及其在龙眼早期体胚发生过程中的调控作用,对植物miR156家族成员的成熟体和前体序列进行多重比对和进化特性分析,并对龙眼miR156基因家族成员进行了前体(pre-miRNA)二级结构预测、靶基因预测及裂解位点验证,利用qPCR技术探究龙眼体胚发生早期miR156a与靶基因SPL6/9/16调控模式.结果表明,龙眼miR156家族含有13条成熟体序列和6条前体序列.Mfold预测显示,pre-miR156家族6个成员的序列均能形成典型稳定的茎环二级结构,它们的最小折叠自由能(ΔG)在-43.30--62.60 kal/mol;成熟序列的碱基保守性高.系统发育进化树分析显示,龙眼miR156家族与水稻、拟南芥的miR156亲缘关系更为接近.靶基因预测显示,龙眼miR156a的靶基因是SPL2、SPL6、SPL9、SPL16、SPL18;利用改良的RLM-RACE在龙眼愈伤组织中检测到SPL6/9/16的断裂片段,miR156a在与靶基因mRNA互补的第10个核苷酸处切割靶标mRNA.实时荧光定量PCR显示,在龙眼体胚发生早期miR156a在0-9 d表达平稳,仅在球形胚(globular embryos,GE)阶段显著下调,SPL6/9/16表达量持续上调,在GE阶段表达量最高,提示SPL6/9/16的大量积累对龙眼球形胚形态建成具有重要作用.本研究表明植物miR156基因家族成熟体序列高度保守,且miR156a的下调表达与靶基因SPL6/9/16的大量积累可能对龙眼球形胚的建成具有重要意义.(图7表2参22)     

龙眼GRF家族全基因组鉴定及表达模式

生长调节因子(growth regulating factor,GRF)是植物体内特有的一种转录因子,在植物生长发育、渗透胁迫中发挥重要的作用.基于龙眼基因组和转录组数据,采用生物信息学分析的方法对龙眼GRF(DlGRF)家族成员进行鉴定命名;分析其基本理化性质、基因结构、蛋白结构域、启动子序列顺式作用元件;构建系统进化树、预测可能直接调控DlGRF的miRNAs;分析DlGRF家族在龙眼非胚性及胚性培养物、组织器官、光质与激素处理下的表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DlGRF的表达模式.结果显示,龙眼DlGRF家族包含9个成员,均含有QLQ和WRC保守结构域;包含2-5个外显子,以3个为主;分布于四大分支上,与甜橙、拟南芥GRF亲缘关系较近;DlGRF蛋白包含7个motif;启动子序列中包含众多光响应、激素应答、厌氧感应、胁迫响应及其他与生长发育相关的作用元件.转录组结果显示,DlGRF家族8个成员在球形胚阶段表达量高于其他阶段;各成员均在种子中有较高表达量,对蓝、白光及激素响应明显. qRT-PCR结果显示,DlGRF1-2、DlGRF2-1、DlGRF2-2、DlGRF4、DlGRF5-1及DlGRF7在球形胚阶段表达量最高;DlGRF1-1、DlGRF1-2、DlGRF2-2及DlGRF5-2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和赤霉素(GA3)等激素处理中表达上调.此外,DlGRF可能受miR396a调控,调控方式为裂解靶标.本研究表明DlGRF在进化过程中保守性较高,且可能受到蓝光和激素的诱导,参与龙眼非胚性及胚性培养物尤其是球形胚及种子发育形成的过程.(图6表3参42)     

龙眼Aquaporin家族的全基因组鉴定及其在体细胞胚发生早期的表达

水孔蛋白(AQP)是生物调控水跨膜运输的重要通道.为了解龙眼AQP基因家族的生物学功能,利用本实验室的龙眼基因组数据库,结合生物信息学的分析方法进行龙眼全基因组范围内AQP家族成员的鉴定,并对其蛋白质理化性质、系统进化关系、共线性、选择压力、基因结构、保守基序、蛋白质保守结构域、顺式作用元件、蛋白质互作和体细胞胚早期不同阶段的基因表达情况进行分析.结果显示,龙眼AQP基因家族共有35个成员,蛋白分子量在17.77×10~3-44.30×10~3 kD之间,分布在14条染色体上;经系统发育树分析,可将其分为5个不同亚家族:PIPs、TIPs、NIPs、SIPs和XIPs;不同亚家族间等电点、磷酸化位点、内含子数量和motif分布差异较大;AQP家族成员间共有6对共线性基因,与拟南芥基因组间有28对共线性基因,且在进化过程中都受纯化选择作用;龙眼AQP家族蛋白质都含有MIP保守结构域;其家族成员可与SYP、PP2A和BOR发生互作,PIP亚家族内的蛋白互作关系最强;基因组的FPKM值分析发现,大部分AQP成员可在龙眼胚胎早期不同阶段进行表达,其中DlTIP4的表达量在所有阶段远高于其他成员,可能在整个过程中发挥着重要作用.本研究表明龙眼35个AQP家族成员基因可能在体细胞胚胎发育阶段发挥重要作用,并且可能响应干旱、低温等非生物胁迫和脱落酸、生长素等植物激素的调控,在功能上具有明显的多样性.(图9表3参55)     

龙眼miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚中的表达模式

MicroRNA403(miR403)为双子叶植物特有的miRNA家族,其在双子叶植物抗病、逆境胁迫和生长发育中具有重要作用.为了解miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚发生过程中的表达模式,利用psRNAtarget对miR403潜在靶标进行预测,采用改良RLM-RACE技术验证其裂解位点,通过qPCR技术检测miR403及其候选靶标对外源激素的应答及在龙眼体胚中的表达模式.结果显示,共获得41个龙眼miR403的潜在靶标,包含4个PPR(Pentatricopeptide repeat protein)和3个PCNT115(Auxin-induced protein PCNT115),却未发现AGO2(Argonaute2).4个PPR中Dlo_014588.1和Dlo_014589.1序列一致,而3个PCNT115基因序列在所预测的miR403结合位点上下游序列基本一致.裂解位点显示,miR403不具备裂解AGO2 mRNA的能力,但介导PPR(Dlo_014588.1)和PCNT115 mRNA的裂解,裂解位点位于miR403 5′端的第2和第3个碱基之间. qPCR显示,miR403响应脱落酸(ABA)信号并显著上调,PPR和PCNT115对不同浓度的ABA呈现不同的表达模式,PPR和PCNT115在5μg/L ABA时显著上调,随后,PPR先显著下调(50μg/L ABA),而后显著上调(5 000μg/L ABA),而PCNT115呈显著下调趋势;miR403不响应赤霉素(GA3)信号,而PPR和PCNT115随着GA3浓度升高而上调;miR403可以响应不同浓度的水杨酸(SA)和2,4-D信号显著下调,而其靶基因显著上调.不同胚性培养物中qPCR显示,miR403仅在龙眼胚性愈伤组织(EC)高度表达且在龙眼体胚发生过程中显著下调,PPR在EC和子叶胚(CE)高度表达,PCNT115在CE和成熟胚(ME)高水平表达,三者之间并未呈现明显的负调控趋势.本研究表明在龙眼体胚中miR403并不靶向调控AGO2,而是调控PPR和PCNT115;另外,miR403可能响应ABA、SA和2,4-D调控PPR和PCNT15参与到龙眼体胚发生过程中.(图5表2参48)     

组培川贝母鳞茎形成和发育过程中的同功酶分析

在组培川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）鳞茎形成和发育过程中，获得愈伤组织、胚性愈伤组织、胚状体、小鳞茎和大鳞茎，分别作过氧化物酶、过氧化氢酶、淀粉酶电沪分析和活性分析。结果表明，3种酶都参与了川贝母鳞茎形成和发育，且酶的表达量和活性随不同的时间发生变化。过氧化物酶的B区酶带变化明显，小鳞茎阶段活性较氧化氢酶在胚状体和大鳞茎阶段几乎不表达，但在小鳞茎阶段表达量增加十分明显，活性也较高；淀粉酶的3条谱带在胚状体阶段表达明显，活性也最高，但在大鳞茎阶段则几乎没有表达。图7参7     

铁观音茶树体胚发生及其内源激素变化

以乌龙茶品种铁观音茶树的未成熟胚为供试材料,建立高效的茶树体胚发生再生体系,同时采用高效液相色谱法(HPLC)分析茶树体胚发生过程中各个不同发育阶段的内源激素含量变化趋势.结果显示,诱导茶树体胚发生的培养基为改良MS培养基+2 mg/L苄基腺嘌呤(BA)+0.2 mg/L吲哚丁酸(IBA)+800 mg/L甜菜碱,体胚增殖系统维持途径的培养基为改良MS培养基+3 mg/L肉桂酸+20 g/L蔗糖+10 g/L山梨醇.当3%蔗糖与2%山梨醇组合使用时,子叶形胚的诱导率明显提高.将诱导产生的子叶形胚转接至添加5%蔗糖与5%聚二乙醇(PEG)的无激素MS培养基中,经过40 d左右培养,体胚能正常成熟.成熟体胚接种在附加2 mg/L BA与0.1 mg/L IBA的MS培养基上可以萌发成苗.在体胚发生早期,玉米素(ZT)和赤霉酸(GA3)含量均是先下降,在子叶形胚时期降至最低值,到体胎发育后期的成熟胚与萌发阶段呈明显上升趋势;脱落酸(ABA)含量由球形胚到子叶形胚阶段一直呈现下降趋势,到成熟胚阶段时,出现一个明显的峰值;球形胚中的吲哚乙酸(IAA)含量显著高于其他阶段,之后迅速降低,波动变化.ABA/IAA的比值先增大,然后减小;ABA/GA3的比值体胚发育前期维持在较高水平,到成熟萌发阶段下降;球形胚阶段IAA/ZT的比值高于其他各个阶段.本研究表明茶树不同发育阶段胚胎的体胚诱导率不同,与生理状态及其内源激素动态变化有关;同时茶树中内源激素含量和比例在体细胞胚胎发育过程中有显著的变化,这种变化在不同胚胎发育阶段起着特定的调节作用.     

荔枝胚性愈伤组织体胚发生系统的优化及转化抗性愈伤组织培养再生植株

首先优化了荔枝(Litchi chinensis Sonn.)幼胚胚性愈伤组织(embryogenic calli,EC)体胚发生的条件，在附加5mg L^-1 ZT的高糖(60g L^-1)高琼脂(10g L^-1)的MS培养基上获得了荔枝高频率(100％)体胚发生；同时，对荔枝体胚成熟和成苗的关键问题作了分析，建立了一套完整的荔枝体胚发生与再生系统，在附加10％椰子汁的高糖(6％)MS培养基上诱导体胚正常成熟，并在无激素MS培养基中诱导体胚萌发，为荔枝转基因研究提供了良好的受体系统．利用此再生系统对荔枝转基因抗性愈伤组织进行体胚发生与再生植株研究，获得了大量再生植株．图1表7参11     

龙眼miR167家族分子特性及其潜在靶标在体胚发生早期的表达模式

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3’端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.(图9表3参54)     

绿僵菌钙传感蛋白基因克隆及其与致病性的关系

通过筛选文库获得绿僵菌钙传感蛋白基因MaNcs1基因全长cDNA序列,并对其在致病过程中的作用进行了分析.结果显示,MaNcs1基因cDNA全长792 bp,开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸;采用RNA干扰技术下调该基因的表达后,对东亚飞蝗的生测实验表明,绿僵菌毒力显著下降,说明该基因与绿僵菌的致病性有关,为以后深入研究该基因的致病机制奠定了基础.     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

人类转录因子样新基因TFL76的初步研究

运用基于基因组数据库特定基因同源基因的克隆策略得到人类新基因TFL76 ,它编码 12个C2 H2 型锌指基序 .其cDNA序列长 2 2 6 8bp,预测的编码蛋白含 6 77个氨基酸 ,分子量 (Mr)为 76× 10 3 .生物信息学分析表明 ,TFL76的N末端含有多种蛋白激酶的磷酸化位点和核定位信号 ,具有转录因子的特征 .染色体定位为 19q13.4 ,此位点存在很多与癌症相关的基因 .对 9.5d和 10 .5d的鼠胚进行全胚原位杂交 ,结果表明 ,此基因在前肢芽和后肢芽表达较高 .图 5表 1参 5     

鸡贫血病毒(CAV)vp1基因的克隆及与其他CAV vp1基因的比较

把一个新鸡贫血病毒(CAV)的vp1基因通过PCR扩增，然后克隆到质粒载体pUC18上．vp1基因包含1347个碱基对，并且推定的VP1蛋白氨基酸序列含有449个氨基酸．通过DNA BLAST软件把该基因的序列数据与在GenBank中发表的其他vp1基因比较显示，克隆的vp1基因与已发表的其他vp1基因之间存在许多核甘酸差异．核甘酸的变异导致其编码蛋白质的某些氨基酸发生改变．氨基酸的改变主要集中在VP1蛋白的29、75、125、141、144、251、254、447位．在这些变异中，许多氨基酸的电荷和／或疏水性发生了改变，例如：Gly→Glu、Val→Glu、Ala→Thr、Leu→Gln、Cys→Trp、Leu→Arg、Arg→Ala、Gly→Ser、Ser→Ala、Glu→Gly、Gly→Thr等．通过CLUSTAL X软件比较了6个不同的vp1基因．该vp1基因已被GenBank登录(登录编号：AF448446)．VP1蛋白是CAV的唯一衣壳蛋白，因此VP1的氨基酸变异可能影响该蛋白质的抗原特征．对该vp1基因进一步进行免疫学研究具有重要意义，并且有可能应用该基因构建CAV基因工程疫苗．图1表3参20     

恒河猴piwil1基因的表达

为了解人类近亲恒河猴piwil1基因的结构、表达和功能差异,利用RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil1基因,并对其编码产物进行了相应的生物信息学分析,随后检测了piwil1 mRNA在成年恒河猴10种组织中的表达情况,最后利用免疫组化方法比较了PIWIL1蛋白在成人、成年恒河猴和幼年恒河猴睾丸组织中表达的异同.结果表明,恒河猴piwil1基因全长2 586 bp,编码861个氨基酸,氨基酸数目与人类piwil1基因相同.恒河猴PIWIL1蛋白与人的PIWIL1蛋白序列同源性达99%,均含有PAZ结构域和Piwi结构域.在成人和成年恒河猴的睾丸组织中,PIWIL1蛋白均在精母细胞和精细胞的胞浆中表达,而在幼年恒河猴睾丸组织中,PIWIL1表达与成年恒河猴相比存在差异,表达量相对较低,且主要表达于生精小管的细胞的细胞核上.上述结果提示,PIWIL1蛋白在成人和成年恒河猴可能具有相同作用,但是在不同的发育阶段中PIWIL1蛋白的功能不同.     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15