生物催化不对称还原制备(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇研究进展

(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成药物阿瑞匹坦的关键中间体.以羰基还原酶生物催化前手性酮3,5-二(三氟甲基)苯乙酮的方法制备该中间体具有立体选择性优异、反应条件温和、对环境友好等优点,近年来受到广泛关注,目前已报道的高立体选择性酶源(产物ee 99%)有10余种.其中原始菌株生物催化体系能够转化底物的浓度普遍低于200 mmol/L,而利用重组Escherichia coli全细胞或者粗酶液则可催化1 mol/L以上的底物.通过添加离子液体、深共熔溶剂等辅溶剂,羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶融合表达以及酶固定化技术等方法优化反应体系可以有效提高底物转化效率.有些羰基还原酶,如LXCAR、KR01、Ch KRED20等,能够催化异丙醇脱氢实现辅酶自循环,其催化体系具有明显优势.未来利用蛋白质工程技术对野生型的潜力酶进行人工进化,可以进一步提高利于工业应用的酶学性能,同时稳定的生产工艺、规模放大、后处理等方面也需要深入开展研究.(图2表3参52)     

一株高效不对称还原产生(R)-苯基乙二醇的菌株筛选、鉴定及全细胞催化体系

(R)-苯基乙二醇是合成许多光学活性药物的重要手性中间体,其制备具有重要的现实意义.以α-羟基苯乙酮为底物,从土壤中筛选得到一株能够立体选择性催化α-羟基苯乙酮产生(R)-苯基乙二醇的细菌菌株HBU-SI7.经形态学观察和16S r DNA序列分析,鉴定此转化菌株为红球菌属菌株Rhodococcus sp.菌株全细胞催化体系研究表明在邻苯二甲酸二丁酯-磷酸盐缓冲液(V:V=1:3)的两相催化体系下,菌体转化α-羟基苯乙酮的最优浓度为3.0 g/L,转化率高达96.2%,e.e值为99.3%.本研究建立的红球菌全细胞催化还原体系对(R)-苯基乙二醇的高效制备具有潜在的研究和应用价值.     

氧化微杆菌C3催化3,5-双三氟甲基苯乙酮的不对称反-Prelog还原(英文)

(R)-3,5-双三氟甲基-1-苯乙醇是合成神经激肽1受体拮抗剂阿瑞匹坦的关键手性醇中间体.通过筛选得到一株氧化微杆菌C3(Microbacterium oxydans C3),其能不对称还原底物3,5-双三氟甲基苯乙酮为(R)-3,5-双三氟甲基-1-苯乙醇.在底物浓度为5 g/L时,生物转化反应40 h,能达到>99%的ee值和95%的底物转化率.底物浓度提高到50 g/L时,生物转化的ee值依然保持99%,并能达到56%的底物转化率.利用该氧化微杆菌C3对其他含氟苯乙酮衍生物进行生物转化反应,同样得到了较高的立体选择性和底物转化率.     

不对称还原α-氨基苯乙酮菌种的筛选及转化条件优化

芳香基手性胺醇是许多手性药物合成的重要手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重要方法之一.以α-氨基苯乙酮盐酸盐为模型底物从土壤中筛选获得两株能分别高立体选择性催化底物产生R型、S型相应醇的菌株,对映体过量值(e.e.)分别为99%和77%,编号为1403和4802,鉴定菌株所属为镰刀菌属和地霉属.对两株菌培养时期和转化条件的研究表明镰刀菌1403最适生长时间为24 h,最优菌体浓度20 g/L,最优底物浓度5 g/L;地霉4802最适生长时间24 h,最优菌体浓度80 g/L,最优底物浓度3 g/L.底物特异性研究表明,菌株1403和4802均可转化α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羟基苯乙酮和苯乙酮为相应醇,且以α-羟基苯乙酮为底物时,其产物均为S型,e.e.值达99%.     

构建辅酶自循环系统全细胞催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇

S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设计了一个结合新金色分枝杆菌来源的醇脱氢酶的级联酶催化体系,从而将较为廉价的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.为了解决级联催化过程中辅酶再生和氨基供体再生问题,在该级联体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶,构建一个封闭的氧化还原自循环系统,从而实现辅酶(NADP~+)和辅底物(L-Glu)的同时再生.最后将这3个酶串联表达在pETDuet和pACYCDuet质粒上,并转入大肠杆菌中,获得了重组菌Escherichia coli BL21(MPG).通过重组菌全细胞转化,结果显示在100 mL、pH 8.0的NH_4Cl溶液中,37℃条件下反应10 h后,OD_(600)=30的该重组菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光学纯的S-2-氨基-1-苯基乙醇,转化率达到99.6%,产物的ee值 99%.本研究提供了一种高效经济催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇的方法,不需要受到辅因子供应不足的限制以及副产物的积累的影响.(图8表3参31)     

树干毕赤酵母不对称还原合成光学纯托伐普坦

外消旋体托伐普坦是治疗重度低钠血症和等容量性低钠血症的关键药物,而光学纯托伐普坦在动物体内具备不同的药代性能,目前尚未有微生物全细胞催化托伐普坦前手性酮(PK1)还原生成光学纯托伐普坦的报道.拟建立微生物合成光学纯托伐普坦的催化体系,对催化过程中所使用的菌种、有机溶剂进行选择,并对有机相与水相比例、菌体浓度、底物浓度和转化时间进行优化.结果显示:本试验选取的5种酵母菌均可将PK1催化还原为S型为主的托伐普坦,选定其中具有较高转化率和e.e.值的树干毕赤酵母作为转化菌株.从多种不同log P值的有机相中筛选出大豆油作为两相催化系统的有机相.通过优化发现两相体系中大豆油与水相的体积比为1:9时为最佳油水比例.当菌体浓度为1.0 g/mL,底物浓度为10.0 mg/mL时转化率显著提高.同时,发现全细胞两相催化体系中产物的积累与时间呈线性关系,并在72 h转化率达到最大值.在以上最佳催化条件下全细胞的转化率可达74.5%,产物e.e.为99.0%.本研究建立的大豆油-水的两相催化体系是一种还原催化难溶性前手性酮底物生成光学纯手性醇类化合物的有效方法.(图7表2参24)     

不对称还原丙酮酸乙酯菌株的筛选及鉴定

以丙酮酸乙酯为底物,从成都某化工厂污水池及其附近土壤中分离到36株可将丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的菌株.经过多次复筛,最终获得了一株具有较高催化活性的酵母菌BTY18-6.在以该菌株静息细胞为催化剂,催化不对称还原丙酮酸乙酯合成(S)-乳酸乙酯的反应中,底物浓度为60 mmol/L时,底物转化率为86.9%,产物(S)-乳酸乙酯的ee值为88.7%.通过对其形态学、生理生化特征及其26S rDNA Dl/D2区域的分析表明,BTY18-6为胶红酵母.     

酶法高效转化苯乙酮酸合成L-苯甘氨酸

L-苯甘氨酸是合成多种抗生素和抗癌药物的重要中间体,目前主要通过化学法合成.利用蜡样芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化苯乙酮酸的还原氨基化合成L-苯甘氨酸,并偶联甲酸脱氢酶(FDH)进行辅酶再生,建立了一种新型的苯甘氨酸生物合成方法.结果表明,该辅酶再生体系可有效地用于L-苯甘氨酸的合成,且没有副产物残留,辅底物甲酸铵还可提供还原氨基化所需NH4+,随后对酶转化条件进行优化,最适转化条件为苯乙酮酸60 g/L,甲酸铵50.4 g/L,LeuDH 4 U/mL,FDH 2 U/mL,NAD+浓度0.14 g/L,p H 8.0以及30℃.在最优条件下,1 L的转化体系中,转化反应5 h,苯乙酮酸转化率达到99%,L-苯甘氨酸产量60.2 g/L,ee值99%.本研究为L-苯甘氨酸的工业生产提供了一种更加简单、高效、经济的生物合成途径.(图8表4参27)     

氯化四(4-磺酸钠苯基)卟啉铁(Ⅲ)催化过氧化氢氧化降解2,4,6-三氯苯酚的动力学研究

用紫外-可见分光光度法研究了水溶性金属卟啉Fe(TPPS)Cl催化H2O2氧化降解2,4,6-三氯苯酚(TCP)的动力学(TPPS为四(4-磺酸钠苯基)卟啉),探讨了反应体系酸度、H2O2/Fe(TPPS)Cl物质的量之比、温度对氧化降解速率的影响,提出了反应机理,建立了反应动力学数学模型.研究结果表明,TCP初始浓度为3.8×10-4 mol.L-1、Fe(TPPS)Cl浓度为4.0×10-5 mol.L-1、H2O2浓度为1.8×10-3mol.L-1、温度为25℃、pH值为6.8、反应时间为90 min时,TCP的降解率可达到99%,其表观活化能为10.96 kJ.mol-1.因此,Fe(TPPS)Cl作为模拟过氧化物酶在催化降解TCP过程中是一种有效的催化剂.     

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2 金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.图4表3参17     

羟丙基-β-环糊精对新金色分枝杆菌合成ADD蛋白质组的影响

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOFMS)分离和鉴定新金色分枝杆菌蛋白质表达量的差异;再使用反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对挑选出的5个与ADD合成相关的蛋白质编码基因进行转录水平分析.结果表明,2-DE图谱及质谱结果共鉴定到12个具有显著差异表达量的蛋白质点.其中,参与植物甾醇降解合成ADD途径的乙醇脱氢酶、烯酰-Co A水合酶、乙酰-Co A乙酰基转移酶、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾-24-烯酰-Co A水合酶和4,5-9,10-双断裂-3-羟基-5,9,17三氧雄甾-1(10),2-二烯-4-酸酯水解酶的蛋白质表达量在羟丙基-β-环糊精存在条件下显著提高;参与糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢的乙二醛酶、3-氧代酰基-ACP合酶、3-酮脂酰-ACP还原酶、分支酸合酶、氮调节蛋白P-II和DNA结合蛋白的蛋白质表达量也有一定的提高,但磷酸甘油酸变位酶的蛋白质表达量有所下降.通过RT-q PCR分析的转录水平的变化情况与2-DE得到的蛋白水平的结果相符.综上所述,羟丙基-β-环糊精可促进降解植物甾醇合成ADD代谢途径及糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢途径相关酶的表达量.     

青霉素G酰化酶突变体酶催化合成顺式头孢丙烯工艺优化

头孢丙烯作为第二代头孢菌素类抗生素,广泛应用于治疗敏感菌所致的上、下呼吸道感染,皮肤和皮肤软组织感染.酶法合成头孢丙烯与化学法相比更加绿色环保.本研究利用来源于大肠杆菌的青霉素G酰化酶(EC 3.5.1.11)野生型WT、突变体βF24A和αF146Y/βF24A合成顺式头孢丙烯(cis-cefprozil).通过比较不同突变体催化顺式头孢丙烯的合成效率,发现突变体βF24A具有较高合成活性及低水解活性.以顺式7-氨基-3-丙烯基-4-头孢烷酸(cis-7-APRA)和对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPGME)为底物合成顺式头孢丙烯.基于水相体系中合成条件优化,最适温度为25℃,最适pH为6.0,底物配比M_(D-HPGME):M_(cis-7-APRA)=3:1,酶用量2.6 U/mL,在此最佳条件下转化率可高达99%.突变体βF24A的固定化酶合成顺式头孢丙烯的转化率为99%,固定化酶连续使用60批次后,活性仍保持52%.本研究对突变体的筛选和酶催化条件的优化,为酶法合成顺式头孢丙烯奠定了基础.     

丹参提取液对球形红细菌菌体蛋白及几种酶的影响

为探索球形红细菌对丹参的生物转化机理,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)分别对丹参水提液、醇提液、醇水提液培养后球形红细菌菌体及纯球形红细菌(PRS)菌体蛋白质(Pro)、酯酶(EST)、细胞色素氧化酶(COD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)进行分析,比较用丹参提取液培养前后球形红细菌菌体蛋白及4种酶的同工酶变化.结果表明:丹参提取液培养前后球形红细菌菌体蛋白及4种酶的同工酶谱带差别较大,同工酶的电泳迁移率、活性、所表达同工酶的数目及分布均有差异,培养d 2～6蛋白及酶表达量变化最大,d 14～20基本稳定.研究表明丹参能诱导球形红细菌生成新的蛋白质及酶,亦可抑制某些蛋白质和酶的合成;这些蛋白和酶可能参与了丹参化学成分的生物转化.图4参22     

Fe~0对土壤中3-硝基甲苯的还原作用

研究常温常压下零价铁(ZVI或Fe0)对土壤中3-硝基甲苯(MNT)的还原作用.结果表明:零价铁能够有效地将土壤中的MNT还原为3-甲基苯胺.在MNT为2.5×10-6mol·-1,铁粉加入量为25mg·g-1,土壤初始pH值为6.8,含水量为75%,温度为25℃的条件下,反应5h后MNT的还原率可达95%.随着体系反应时间的延长,温度的升高,土壤含水量的增大和铁粉用量的增加,MNT的还原率均增大.将土壤初始pH值控制在偏酸性有利于反应的进行.     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析

通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.     

猪精液酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化及性质水

以杜洛克猪精液为材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得纯化倍数为27.64、比活力为1 773.25 U mg~(-1)的酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯酶制剂.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,纯酶两种亚基相对分子质量分别为129.13×10~3和62.24×10~3.对其酶学性质的研究结果表明,酶的等电点为5.10,最适pH值为5.5,最适温度为60℃.酶在pH 3.6~9.2、温度10℃～55 ℃的范围内较稳定.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨罐葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得米氏常数K_m为0.455 mmol L~(-1),最大反应速度V_m为17.34μmol L~(-1)min~(-1),活化能为41.70 kJ mol~(-1).图8表1参15     

烯酮还原酶基因的克隆与优化表达

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.     

高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及酶学、转酯特性

从自然环境中筛选水解酶活高且酶学、转酯特性优良的产脂肪酶菌株,对脂肪酶工业化发酵生产及生物柴油制备的研究具有重要意义.采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法,从70份含油脂丰富的样品中筛选产脂肪酶酶活较高的菌株进行16S rRNA鉴定,研究其酶学性质;用大孔树脂固定酶,在无溶剂体系中催化橄榄油制备生物柴油,研究其转酯特性.结果筛选到一株高产脂肪酶的菌株WZ10-3,通过p-NPP法测得其初始酶活为78.68 U/mL,经16S rRNA鉴定属于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.),与B.stabilis同源性达到99%.该菌在发酵48 h时达到产酶高峰,所产脂肪酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为7.0,70℃下的半衰期可达1 h,pH为7-9时稳定性良好.以大孔树脂NKA-9和HPD600为载体制备的2种固定化脂肪酶,催化橄榄油生产生物柴油的转酯率均可达到97%.综合表明,菌株WZ10-3脂肪酶的初始水解酶活高于大多数野生脂肪酶,热稳定性好且转酯特性优良,有很好的后续研究价值.图7表3参25     

低温反硝化过程中pH对亚硝酸盐积累的影响

以乙酸钠为单一碳源,在C/N比为3、温度为12—14℃的低C/N比、低温条件下通过间歇试验研究p H对反硝化亚硝酸盐积累规律影响.试验结果发现,在C/N为3时,p H值在7—9的范围内都能形成亚硝酸盐积累.反应时间为60 min时,亚硝酸盐积累率最大可达50%左右.低温SBR反应器连续试验研究表明,p H值为7.4±0.1和p H值为8.4±0.1时,序批式活性污泥法(SBR)出水亚硝酸盐积累率分别为51%和48%,取p H值为7.4±0.1条件下SBR反应器活性污泥进行酶活力测定发现,硝酸盐还原酶活力是亚硝酸盐还原酶活力的1.2倍,硝酸盐还原酶活力与亚硝酸盐还原酶活力对外界条件变化敏感程度不同,亚硝酸盐还原酶对外界条件变化更为敏感,其受到的抑制作用要大于硝酸盐还原酶,进而造成NO-2-N的积累.     

己唑醇在土壤中的吸附-解吸特性

采用批量平衡法和气相色谱法研究了己唑醇在3种土壤中的吸附-解吸特性.结果表明,己唑醇在3种供试土壤中的等温吸附-解吸曲线能较好地符合Freundlich模型,其吸附常数(Kf)分别为0.791、2.274和43.800,显示3种土壤吸附行为存在较大差异.吸附率与土壤有机质含量(OM)、土壤阳离子交换量(CEC)和粘粒含量呈良好相关性.己唑醇在粘土和壤土中的等温吸附线属于L型等温吸附线,砂土中属S型.己唑醇在土壤中的吸附自由能为-5.186—-8.164 kJ.mol-1,表示吸附机理主要为物理吸附.