假单胞杆菌抗镉基因的克隆

以pBR322为载体,将抗镉的假单胞杆菌R4染色体的抗镉基因克隆至大肠杆菌HB101,从5000个重组体中筛选出一株抗镉基因克隆株,命名为大肠杆菌HB101(pBC311)。重组质粒pBC311经PstⅠ酶解和琼脂糖凝胶电泳证实抗镉基因位于3.6kb长的PstⅠ片段上。克隆菌株可在含100μg/ml CdCl_2的L-肉汤中生长,其生长停滞期比受体大肠杆菌HB101短得多,说明克隆菌株含有抗镉基因。     

降解-示踪质粒的构建及性能评价研究

在生物强化中采用报告基因技术对降解质粒进行标记,可实现对基因工程菌和降解基因的原位监测。通过基因克隆技术,将绿色荧光蛋白基因(gfp)和阿特拉津脱氯水解酶基因(atzA)重组,构建降解-示踪功能质粒,实现对阿特拉津降解质粒的示踪标记,并对转化获得的基因工程菌绿色荧光蛋白表达及阿特拉津降解能力进行评价。结果表明将gfp和atzA基因克隆至质粒载体pUC18所获得的重组质粒,经检测含有atzA基因,具有氨苄青霉素抗性,并可表达绿色荧光蛋白。携带重组质粒的基因工程菌具有阿特拉津降解活性;且在活性污泥中产生绿色荧光现象,可通过原位观察进行监测。     

不同系统pJP4质粒介导基因强化降解2,4-D效应研究

以携带pJP4质粒的基因工程菌Pseudomonas putida SM1443∷gfp2x(pJP4∷dsRed)为供体菌,考察了pJP4质粒在4种纯菌中的转移效应;并分别针对活性污泥、生物膜、颗粒污泥和河流沉积物系统,通过实验室小试实验考察了该基因工程菌对不同系统目标污染物2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的强化降解效应.结果表明,该基因工程菌中的pJP4质粒能够以广泛的微生物细胞为受体菌发生水平转移;向活性污泥、生物膜、颗粒污泥和河流沉积物系统加入一定量的基因工程菌,对2,4-D的降解都能够产生明显的促进作用.对于活性污泥系统（2,4-D初始浓度为450 mg/L）,强化与对照系统反应143.5　h时2,4-D去除率分别为66％和54％;对于生物膜系统（2,4-D初始浓度为180　mg/L）,强化与对照系统在反应113　h时对其去除率分别为99％和61％;对于颗粒污泥系统（2,4-D初始浓度为160　mg/L）,强化系统2,4-D在62　h接近完全去除,而对照系统66　h去除率仅为26％;对于沉积物系统（2,4-D初始浓度为2　mg/L）,强化与对照系统344　h去除率分别为93％和69％.激光共聚集扫描显微（CLSM）分析揭示并证实了不同基因强化系统接合子的形成与存在.     

真菌对磺胺二甲氧嘧啶降解过程的转录组分析及差异表达基因的功能分析

采用黄孢原毛平革菌降解磺胺二甲氧嘧啶（SDM）,4 d后SDM的去除率达74%,降解速率达3.24 mg·L^-1·d^-1.采用Illumina高通量测序平台对降解SDM后的菌株与对照组菌株进行测序,通过GO和KEGG富集分析,得到的差异表达基因能显著富集到与降解相关的“氧化还原酶活性”途径,及与应激反应有关的“ABC转运体”路径.通过对高表达高上调的差异表达基因的筛选与分析,得到了耐受和降解SDM的功能基因.水通道蛋白、ABC转运蛋白及甲基转运酶基因等在黄孢原毛平革菌对环境的耐受中起到重要的作用.乙醇氧化酶、细胞色素P450和糖苷水解酶等在黄孢原毛平革菌对SDM的降解中起着关键的作用.本文从转录组水平分析了SDM的降解机制,为黄孢原毛平革菌在环境修复中的应用提供一定的参考.     

苯甲酸厌氧降解机理及功能基因的研究进展

对芳香化合物降解重要中间体的苯甲酸在厌氧条件下的降解途径及机理。指出了降解过程中每一步骤所涉及的酶及其相关基因。并对其中关键的辅酶进行了的阐述     

底物类型对厌氧消化过程中胞内外抗生素抗性基因归趋的影响研究

厌氧消化（anaerobic digestion,AD）是畜禽粪污和剩余污泥重要的处理处置方式,其在能源回收和消减抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）中具有重要的应用前景.底物类型及预处理是影响厌氧消化过程的重要因素,其对ARGs归趋特征的影响尚不明确.本研究针对猪粪、鸡粪和剩余污泥3种典型的环境ARGs源为研究对象,明确不同底物类型对厌氧消化中ARGs归趋的影响特征,结合胞内ARGs （Intracellular ARGs,iARGs）和胞外ARGs （Extracellular ARGs,eARGs）及其微生物群落结构演替的差异,探讨不同底物类型在厌氧消化过程中ARGs的响应特征.结果表明,底物类型对厌氧消化过程中的胞内外ARGs的变化具有显著的影响.高压蒸汽灭菌（120℃,30 min）预处理底物对厌氧消化结束时的总累积甲烷产气量没有显著的提高,鸡粪组中出现产气抑制的现象,这与之前的研究一致.不同底物类型样品中DNA浓度与DNA中16S rRNA基因的丰度之间存在显著相关性（R²=0.663,p<0.05）.底物中微生物对厌氧消化中iARGs和eARGs的转归贡献率较小,剩余污泥中的eARG在总ARGs中的比例最高（5.47%）.在不同底物类型中iARG和eARGs的变化均显著不同.     

嗜盐菌群对菲的降解及萘双加氧酶基因的表达规律

从胜利油田富集了一个能够降解多环芳烃的嗜盐菌群,通过克隆文库技术解析了菌群萘双加氧酶(ndo)基因的多样性.结果表明,该嗜盐菌群有6种ndo基因型,其中3种主要基因型(占总克隆子92.7%)与经典nah-like基因的相似度为89%.采用real-time RT-PCR等技术分析了不同盐度下菲降解过程中ndo基因的表达量、降解速率、生长曲线以及菲的生物可利用度,探索了菌群对菲的降解及ndo基因的表达规律.结果表明,当盐度由10%升高到20%,菌群完全降解100mg/L菲的时间从6d延长到9d,菌群生长的迟滞期由1d延长为3d.溶解菲的浓度在菌群生长过程中呈增加的趋势.Ndo基因的表达量在降解过程中呈先降低后随溶解菲浓度升高而升高的趋势,表明高浓度菲在初始阶段可能抑制ndo基因的表达.单因素方差分析(n=3, P>0.05)表明溶解菲浓度在10%和20%盐度下没有显著差异,表明一定范围的盐度不会影响菌群降解过程中菲的溶解度.菌群ndo基因的相对表达量在10%盐度下较在20%盐度下高,说明盐度对嗜盐菌群功能基因的表达具有抑制作用.     

四环素抗生素对污泥中四环素抗性基因丰度和表达水平的作用影响

为研究四环素(TC)抗生素对其抗性基因(TC-ARGs)转录表达的作用影响,以从活性污泥中筛选获得的四环素抗性细菌(TRB)作为研究对象,采用荧光定量PCR和逆转录PCR方法检测了7种TC-ARGs,包括tet A、tet C、tet G、tet M、tet O、tet W和tet X基因的丰度和表达水平,并探讨了TC与TC-ARGs丰度及其表达水平之间的相关关系.结果表明,在整个培养周期内,tet A、tet G和tet W基因丰度随TC暴露浓度的增大总体呈现上升趋势,但其余TC-ARGs基因丰度整体波动较大. TC胁迫对不同TC-ARGs的转录表达水平作用影响差别较大,其中,tet A基因表达水平相对稳定,且随TC浓度的升高而上调,在TC浓度为100 mg·L~(-1)时,其上调倍数高达5. 3倍.在短期(1 d) TC胁迫下,TC-ARGs转录表达水平随TC浓度的升高整体呈现上调趋势.由相关性分析可知,tet A和tet W基因丰度与其转录表达水平之间存在显著的线性相关性,表明其基因丰度可在一定程度上衡量和评价其抗性表达水平,进而反映其功能活性和环境风险.     

木质素过氧化物酶LiPH2合成基因在毕赤酵母中的表达

应用化学合成方法获得了碱基序列优化后的木质素过氧化物酶LiPH2合成基因.分别将去除和含有自身信号肽的合成基因与几种选定的表达载体连接,并转化进入相应的Pichiapastoris宿主菌中,共构建了8个不同的毕赤酵母表达系统.对酵母转化子基因及对其发酵液中重组蛋白的分析结果表明,其中1个表达系统的酵母转化子能够成功分泌LiPH2重组蛋白.同时,对影响目的基因表达的各种因素的分析结果表明:就不同宿主菌而言,SMD1168与表达成功的X-33受体菌在其余因素相同的情况下无分泌蛋白表达,pep4基因的缺失对LiPH2蛋白的表达有不利影响;;就不同分泌信号肽而言,与α因子信号肽相比,LiPH2自身信号肽更有利于引导LiPH2的分泌表达;;就不同表达载体而言,其对外源蛋白的表达存在较大差别.本研究中得到的重组蛋白分子量有所增加,说明很可能存在过度糖基化的影响,过度糖基化和C-端氨基酸的增加可能是造成表达蛋白没有活性的原因.     

双酚A降解菌的分离鉴定及降解基因的定位

从土壤中分离到一株双酚A降解菌W2。该菌可在饱和的双酚A溶液里以其为唯一碳源与能源生长。具有较强的双酚A降解能力。通过16SrDNA序列分析与形态与生理生化分析,该菌株为假单胞菌。通过质粒丢失实验、质粒转化实验证明该基因位于一个19kb左右的质粒上。     

Preimplantation genetic diagnosis for single gene disorders: experience with five single gene disorders

We report our experience of 14 preimplantation genetic diagnosis (PGD) cycles in eight couples carrying five different single gene disorders, during the last 18 months. Diagnoses were performed for myotonic dystrophy (DM), cystic fibrosis (CF) [ΔF508 and exon 4 (621+1 G>T)], fragile X and CF simultaneously, and two disorders for which PGD had not been previously attempted, namely neurofibromatosis type 2 (NF2) and Crouzon syndrome. Diagnoses for single gene disorders were carried out on ideally two blastomeres biopsied from Day 3 embryos. A highly polymorphic marker was included in each diagnosis to control against contamination. For the dominant disorders, where possible, linked polymorphisms provided an additional means of determining the genotype of the embryo hence reducing the risk of misdiagnosis due to allele dropout (ADO). Multiplex fluorescent polymerase chain reaction (F-PCR) was used in all cases, followed by fragment analysis and/or single-stranded conformation polymorphism (SSCP) for genotyping. Embryo transfer was performed in 13 cycles resulting in one biochemical pregnancy for CF, three normal deliveries (a twin and a singleton) and one early miscarriage for DM and a singleton for Crouzon syndrome. In each case the untransferred embryos were used to confirm the diagnoses performed on the biopsied cells. The results were concordant in all cases. The inclusion of a polymorphic marker allowed the detection of extraneous DNA contamination in two cells from one case. Knowing the genotype of the contaminating DNA allowed its origin to be traced. All five pregnancies were obtained from embryos in which two blastomeres were biopsied for the diagnosis. Our data demonstrate the successful strategy of using multiplex PCR to simultaneously amplify the mutation site and a polymorphic locus, fluorescent PCR technology to achieve greater sensitivity, and two-cell biopsy to increase the efficiency and success of diagnoses. Copyright © 2002 John Wiley & Sons, Ltd.     

Identification and characterization of integron mediated antibiotic resistance in pentachlorophenol degrading bacterium isolated from the chemostat

A bacterial consortium was developed by continuous enrichment of microbial population isolated from sediment core of pulp and paper mill e uent in mineral salts medium (MSM) supplemented with pentachlorophenol (PCP) as sole source of carbon and energy in the chemostat. The consortia contained three bacterial strains. They were identified as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter sp. by 16S rRNA gene sequence analysis. Acinetobacter sp. readily degraded PCP through the formation of tetrachloro-phydroquinone (TecH), 2-chloro-1,4-benzenediol and products of ortho ring cleavage detected by gas chromatograph/mass spectrometer (GC-MS). Out of the three acclimated PCP degrading bacterial strains only one strain, Acinetobacter sp. showed the presence of integron gene cassette as a marker of its stability and antibiotic resistance. The strain possessed a 4.17 kb amplicon with 22 ORF’s. The plasmid isolated from the Acinetobacter sp. was subjected to shotgun cloning through restriction digestion by BamHI, HindIII and SalI, ligated to pUC19 vector and transformed into E. coli XLBlue1 , and finally selected on MSM containing PCP as sole source of carbon and energy with ampicillin as antibiotic marker. DNA sequence analysis of recombinant clones indicated homology with integron gene cassette and multiple antibiotic resistance genes.     

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.: EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经His-Tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0.     

农作物品种单一化的影响

绿色革命是人与自然关系的产物--集约型农业与高产农业的一大壮举.但绿色革命带来的负面影响也是巨大的,主要是农作物品种单一化引起的农业种质资源的减少和农业生态系统的脆弱.本文就绿色革命的这一负面影响进行阐述并提出对策.     

柱孢藻毒素对草鱼淋巴细胞毒效应及氧化损伤机理研究

针对淡水水体拟柱孢藻水华产生的柱孢藻毒素,以我国典型食用鱼种草鱼(Ctenophar yngodon idellus)为实验材料,研究了其对鱼体免疫细胞毒效应及机理.结果表明,随着体外暴露剂量的增加,草鱼淋巴细胞活性逐渐降低,暴露24h后100μg·L-1柱孢藻毒素诱导组细胞活性仅为对照组的20%;对诱导组淋巴细胞的DNA检测发现呈现阶梯状电泳的典型细胞凋亡特征;应用流式细胞仪进一步检测了细胞凋亡率,表明1～100μg·L-1柱孢藻毒素均能够诱导细胞凋亡,并且其凋亡毒效应呈现明显的时间-效应和剂量-效应关系;诱导12h后,氧化应激产物活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量均明显上升,100μg·L-1柱孢藻毒素诱导组ROS含量为对照组的2.5倍,MDA含量为对照组的2倍,诱导24h后,1、10、50和100μg·L-1实验组氧化应激产物含量仍然明显上升,这说明氧化应激是柱孢藻毒素导致草鱼淋巴细胞DNA损伤的重要原因;RT-PCR技术对重要凋亡基因的检测表明,1～100μg·L-1实验组凋亡促进基因Bax表达显著增强(p<0.05),50和100μg·L-1高剂量组凋亡抑制基因Bcl-2表达显著降低(p<0.01).本研究从细胞水平揭示柱孢藻毒素对草鱼免疫细胞具有明显的毒性,该毒效应通过氧化应激介导的DNA损伤表现,凋亡是柱孢藻毒素对草鱼免疫细胞毒性的主要机制.     

环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。      

几株亚硝化菌的筛选及初步鉴定

通过富集培养获得了几株自养型氨氧化菌，在进行形态学和生化检验之后，又设计了几对引物，以扩增亚硝化菌的特征性基因Amoa。试验表明，不同菌株采用不同引物，均扩增出了预期片段，所以可初步断定，所筛选到的菌种确为亚硝化菌。     

四环素胁迫对Shigella flexneri细菌四环素抗性基因抗性表达的影响过程

四环素(TC)抗生素在不同环境介质中已被广泛检出,为研究其对四环素抗性基因(TC-ARGs)丰度变化及表达水平的影响过程,以从活性污泥中筛选和纯化分离获得的弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)为研究对象,考察了不同浓度TC对其生长过程的作用影响,采用荧光定量PCR和逆转录PCR方法定量检测了不同抗性机制TC-ARGs,包括tetC、tetO和tetX基因的丰度变化及表达水平,并探讨了TC浓度与TC-ARGs丰度及其表达水平之间的相关关系.结果表明,在培养周期内(24 h),TC胁迫对Shigella flexneri细菌的生长具有抑制作用,细菌细胞浓度增长速率随TC暴露浓度的升高而降低,但对TC-ARGs丰度变化影响较小.TC胁迫能够促进Shigella flexneri细菌TC-ARGs的转录表达,tetC、tetO和tetX基因表达水平在整个培养周期内均先升高后降低.由相关性分析可知,TC浓度与TC-ARGs丰度及其表达水平之间相关关系不显著,但tetC和tetO基因丰度与其转录表达水平之间存在显著的正相关关系,表明其基因丰度一定程度上可用来衡量和评价其抗性表达水平.