基于分子技术的1株产毒藻藻际细菌多样性分析

采用构建16S rDNA克隆文库的方法,对实验室保存的1株产毒塔玛亚历山大藻在不同时期的藻际细菌群落多样性进行了分析.限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)结果表明,塔玛亚历山大藻藻际微生物的16S rDNA克隆文库中的克隆子总共可分为 34 种基因型,选取各谱型的代表克隆子测定其16S rDNA片段核苷酸序列,将所获得的序列与GenBank数据库进行BLAST比对,结果表明所有基因型分属于2个细菌类群：变形细菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes).在延滞期的藻培养液中,α-Proteobacteria占36.4%,β-Proteobacteria占9.1%,γ-Proteobacteria占27.3%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占27.3%;在指数后期的培养液中,α-Proteobacteria占53.3%,β-Proteobacteria占13.3%,γ-Proteobacteria占6.7%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占26.7%; 在稳定期的培养液中,α-Proteobacteria占47.8%,β-Proteobacteria占8.7%,γ-Proteobacteria占21.7%,δ-Proteobacteria占4.3%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占17.4%;其中有不少克隆子与已知序列同源性低于 94%,表明塔玛亚历山大藻藻际环境中附着有新的未开发的微生物资源,这些细菌可能在微藻的生消过程中起着重要的调控作用,所以本研究结果在赤潮微生物调控中具有重要的理论意义和应用价值.     

中肋骨条藻与锥状斯氏藻藻际细菌溶藻效应研究

通过向对数生长期的中肋骨条藻和锥状斯氏藻培养体系中分别加入体积分数1%和10%的2216E培养基,以未加入培养基的对照组和10%无菌组作为对照,研究藻际细菌的溶藻效应.结果表明,对照组、1%组及10%无菌组的中肋骨条藻和锥状斯氏藻生长未受抑制,而10%组的中肋骨条藻和锥状斯氏藻生长则受到显著的抑制(p0.001),在第96h时,藻细胞几乎都被裂解,藻细胞数、叶绿素a含量及叶绿素荧光效率(Fv/Fm)显著低于对照组、1%组及10%无菌组(p0.001),表明藻际细菌具有抑制微藻生长的作用.在整个溶藻过程中,中肋骨条藻10%组细菌丰度增加了约250倍,锥状斯氏藻10%组藻际细菌丰度增加了约300倍,藻际细菌丰度的剧增可能是溶藻的主要原因.作为溶藻效果的评价指标,叶绿素荧光效率要优于细胞形态的改变、藻细胞数量的变化及叶绿素a含量,是较理想的溶藻检验指标.     

营养物质对铜绿微囊藻生长和藻际细菌的影响

菌-藻"体系在水生态平衡中发挥重要作用,为探明蓝藻水华时期的菌藻关系,研究了原位营养刺激后藻际微生物对铜绿微囊藻生长的影响.结果表明,LB培养基可抑制铜绿微囊藻生长,抑藻率为86.49%;而乙酸钠、葡萄糖和柠檬酸钠可促进藻细胞生长,增长率均在50%以上.对LB培养基和蛋白胨刺激后的藻际细菌进行溶藻菌的筛选,共分离出6株具有强效抑藻作用的菌株,其中Bacillus sp.A1抑藻率高达97.55%.16S rRNA高通量测序表明,向铜绿微囊藻中投加营养物质均可改变藻际细菌群落结构并增加物种丰富度,添加LB培养基和蛋白胨可促使藻际细菌群落数量剧增.生理生化响应表明,藻细胞受LB培养基和蛋白胨胁迫后,活性氧（ROS）水平和丙二醛（MDA）含量激增,细胞氧化损伤严重;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性先急剧上升后下降,抗氧化酶系统受损.扫描电镜显示,LB培养基可使藻细胞逐渐萎缩,最终破碎;而藻际细菌显著增多.因此,在蓝藻水华暴发的水体进行适当的外部营养刺激可在一定程度上实现溶藻菌原位抑藻.     

氮源对双胞旋沟藻生长和链状形态的影响

通过研究不同氮源对双胞旋沟藻(Cochlodinium geminatum)生长和链状结构的影响,探索双胞旋沟藻生长、形态建成和藻华发生的影响因素。研究发现,高浓度NH4-N对双胞旋沟藻具有毒害作用,而NO3-N和尿素支持双胞旋沟藻的生长及双细胞链状结构的形成。双胞旋沟藻偏好吸收尿素,其最大生物量(1.2×107/L),最高生长率(0.19 d-1)均高于NO3-N组,并且尿素组指数生长期约40%的细胞以双胞链状结构存在,其数量达到2 146/mL,亦明显高于NO3-N组。近海水体中日益增加的尿素含量有助于提高旋沟藻藻华的发生规模和频率。     

高通量测序法表征潜流人工湿地中不同植物根际细菌群落特征

为了研究人工湿地中植物根际、污水水质和深度等对细菌群落结构特征分布的影响,利用高通量测序技术,对人工湿地中芦苇(Phragmites communis)、香蒲(Typha orientalis Presl)2种植物根际3个不同深度细菌群落特征进行了研究.细菌群落丰富度和多样性研究结果表明,芦苇根际细菌群落丰富度和多样性均大于香蒲根际,细菌在芦苇根际周围可以更好地生存;同一植物根际细菌的丰富度和多样性随着深度的增加逐渐减少.相似度和差异性分析结果表明,相同植物根际细菌群落结构相似度较高,而不同根际群落结构有一定的差别.优势细菌菌群分析结果发现,细菌群落在门类水平上达到13门以上,优势细菌种群均以变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门为主,相对丰度约为55%~78%;纲类水平也达到20纲以上,主要有α-变形杆菌纲、β-变形菌、δ-变形菌纲、γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲、酸杆菌纲、相对丰度达到50%以上,植物根际富集的主要纲类细菌是β-变形菌纲.影响细菌群落结构丰富度和多样性的主要环境因素是营养物浓度、植物、采样深度和温度.     

温度和盐度对条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)生长的影响

在实验室条件下,研究了温度和盐度对条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)生长的影响。在28个温度(15～30℃)和盐度(0～35)组合中,条纹环沟藻在20℃和盐度25下生长最好。适宜生长温度为20～25℃,盐度为20～25。在适宜的盐度下,藻细胞对高/低温度的忍耐能力增强,同样适宜温度也可促进藻细胞对高/低盐度的抵抗能力。条纹环沟藻不能在无盐环境生长,但在适温下(20～25℃),能在盐度为10的条件下生长。研究结果说明条纹环沟藻是一种广盐生物,能适应较低的盐度,这也是其赤潮多在低盐的河口海域发生的重要原因。     

铜绿微囊藻与藻际细菌Ma-B1菌株的相互作用

藻与细菌通常共生于淡水生境,形成藻-菌共生体系,藻际细菌是水体生态系统中的重要组成部分,对藻的消长起重要的调控作用,但有关藻际微环境中藻与细菌的互作机制还不清楚. 采用传统的细菌平板培养方法,从太湖优势水华藻——铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞表面分离出一株藻际细菌Ma-B1,基于生理、生化试验和16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus). 通过测定细胞生长,分析藻-菌相互作用机理. 结果表明:一定浓度(＞60 μg/mL)的Ma-B1的胞外代谢物可显著抑制铜绿微囊藻的生长(培养基为BG11,28 ℃/日,22 ℃/夜,3 000 lx,光暗比为14 h∶10 h);铜绿微囊藻的胞外滤液(500 μL/mL)对Ma-B1的生长有一定的促进作用,但其总滤液(500 μL/mL)显著促进Ma-B1的生长;Ma-B1细胞对铜绿微囊藻的生长没有显著影响,而高浓度(藻菌比10∶1)的铜绿微囊藻细胞则可显著抑制Ma-B1的生长. 铜绿微囊藻与Ma-B1之间存在复杂的相互抑制或促进关系,共同影响着藻、菌在自然水体生态系统中的消长.      

赤潮异弯藻对黑鲷仔鱼的毒性研究

以黑鲷(Sparus macrocephalus)仔鱼致死率为指标,进行了赤潮异弯藻鱼毒性源起的探寻.分别就赤潮异弯藻细胞数、种群生长时期、去藻滤液、藻粉提取液的毒性特征进行了研究.实验结果表明:(1) 赤潮异弯藻藻细胞数越高,对黑鲷仔鱼的致死性越大.当藻细胞数达到105 /mL时,5 h内出现明显致死现象.毒性作用主要源于细胞外分泌物质.(2) 不同种群生长期的赤潮异弯藻去藻过滤液对黑鲷仔鱼的毒性存在差异:指数生长期产生的毒性相对较弱,平台期和衰亡期呈现显著的5 h急性致死作用.(3) 用活性炭对平台期和衰亡期的去藻过滤液进行吸附处理,可以使去藻过滤液对黑鲷仔鱼的5 h致死率明显减弱.但24 h致死率仍为100%.(4) 利用冻干藻粉溶液过滤液对黑鲷仔鱼的毒性实验结果发现:冻干藻粉溶液过滤液仍然呈现出与浓度相关的毒性作用特征,滤液对黑鲷仔鱼的24 h半致死浓度相当于每mL溶液中含0.1 mg的干藻粉形成的溶液浓度.赤潮异弯藻的细胞和生长水体中都具有典型的鱼毒性特征.     

溶藻细菌L7(Algicidal Bacteria Strain L7)与中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的相互作用

将6组不同初始种群密度的溶藻细菌L7(Bacillus cereus)菌悬液和添加了溶藻细菌L7胞内、外代谢产物的2216E培养液加入到中肋骨条藻(Skeletonema costatum)悬浮液中,将5组不同初始种群密度的中肋骨条藻悬浮液和添加了中肋骨条藻胞内外代谢产物的f/2-Si培养液加入到溶藻细菌L7悬浮液中,探讨溶藻细菌L7和中肋骨条藻的相互作用。在第7天时,L7胞外代谢产物使中肋骨条藻细胞数量下降95.42%,表现为间接溶藻,胞内代谢产物使藻细胞数量增长361.47%,表现为加快藻增长。L7初始种群密度为3.89×106 cfu/mL和3.89×107 cfu/mL时,在第7天藻细胞数量均下降80%以上;初始种群密度为3.89×102~3.89×104 cfu/mL时,在第7天L7促进藻生长。中肋骨条藻种群密度为3.89×103 cells/L、3.89×104 cells/L及3.89×106 cells/L时,最迟于第7天,L7种群密度开始低于对照组,即中肋骨条藻能够在一段时间后抑制L7生长。从第4天开始,中肋骨条藻胞外代谢产物使L7种群密度低于对照组,即中肋骨条藻对L7产生抑制作用;胞内代谢产物对L7生长的影响不明显。     

溶藻细菌L7代谢物对水华鱼腥藻的溶藻效应

从等体积不同密度的溶藻细菌L7菌液中提取胞内、胞外代谢物,分别加入等体积等密度的水华鱼腥藻中连续培养7d,研究L7代谢物对水华鱼腥藻的溶藻效应。2.78×105~2.78×10 7cfu/mL的L7胞内代谢物能显著促进藻生长和异形胞分化,到培养结束藻密度为对照组的1.7~1.98倍;异形胞数最大可为对照组的2.31倍。2.78×10 8、2.78×10 9cfu/mL的L7胞内代谢物能抑制藻生长,藻密度最低为对照组的58%;能极显著抑制异形胞分化,可不形成异形胞。2.78×10 5~2.78×109 cfu/mL的L7胞外代谢物能极显著抑制藻生长和异形胞分化,藻密度最低为对照组的0.63%,不形成异形胞;藻丝的藻细胞间隔变模糊,藻细胞变大变形,并有大量的单个球形藻体散落。L7主要通过分泌胞外代谢物溶藻,菌胞内代谢物对藻生长有"低促高抑"的作用。     

不同生育期转基因抗虫棉根际土壤细菌群落特征

为深入理解转Bt基因抗虫棉对根际土壤微生物群落的影响,基于大田试验,采用高通量测序技术,研究了不同生育期(播种前期、苗期和吐絮期)转基因抗虫棉和亲本根际土壤微生物群落组成和多样性.结果表明:①转基因抗虫棉及亲本根际土壤优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria,相对丰度为0.433 8~0.499 3)、拟杆菌门(Bacteroidetes,相对丰度为0.106 0~0.136 6)、放线菌门(Actinobacteria,相对丰度为0.074 9~0.146 4)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes,相对丰度为0.054 2~0.072 3)、酸杆菌门(Acidobacteria,相对丰度为0.053 8~0.089 9).不同生育期转基因抗虫棉对根际土壤细菌优势菌门相对丰度产生显著影响(P < 0.05).②不同生育期转基因抗虫棉与亲本根际土壤细菌群落的Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Sobs指数、PD指数均无显著差异(P>0.05),但PCoA分析发现,苗期和吐絮期转基因抗虫棉和亲本的土壤微生物群落出现空间分异(P < 0.05).③转基因抗虫棉根际土壤Bt蛋白含量在不同生育期具有显著差异(P < 0.05),且苗期和吐絮期转基因抗虫棉根际土壤Bt蛋白含量显著高于亲本(P < 0.05).④根际土壤Bt蛋白含量与细菌优势菌门相对丰度呈显著相关(P < 0.05).研究显示,不同生育期转基因抗虫棉通过根际Bt蛋白对土壤细菌相对丰度及群落结构产生影响,但不影响土壤细菌的alpha多样性.      

Phylogenetic diversity and specificity of bacteria associated with Microcystis aeruginosa and other cyanobacteria

Interactions between bacteria and cyanobacteria have been suggested to have a potential to influence harmful algal bloom dynamics; however, little information on these interactions has been reported. In this study, the bacterial communities associated with five strains of Microcystis aeruginosa, three species of other Microcystis spp., and four representative species of non-Microcystis cyanobacteria were compared. Bacterial 16S rDNA fragments were amplified and separated by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) followed by DNA sequence analysis. The similarities among bacterial communities associated with these cyanobacteria were compared to the digitized DGGE profiles using the cluster analyses. The bacterial community structure of all cyanobacterial cultures di ered. Cluster analysis showed that the similarity values among M. aeruginosa cultures were higher than those of other cyanobacterial cultures. Sequence analysis of DGGE fragments indicated the presence of bacteria including, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacteroidetes and Actinobacteria in the cyanobacterial cultures. Members of the Sphingomonadales were the prevalent group among the Microcystis-associated bacteria. The results provided further evidence for species-specific associations between cyanoabcteria and heterotrophic bacteria, which are useful for understanding interactions between Microcystis and their associated bacteria.     

南淝河细菌群落结构的研究

为了研究受污染城市河道南淝河在进行修复前微生物群落的多样性,于2009年10月(秋季)和2010年1月(冬季)在南淝河河道中采集水样,直接从水中提取总DNA,用细菌16S rDNA的通用引物对V3区进行PCR扩增,PCR产物经DGGE(变形梯度凝胶电泳)分离后,获得水体细菌群落的DGGE指纹图谱;同时运用平板计数法对水体的异养细菌进行计数。结果表明:不同季节,不同位点南淝河的细菌群落的多样性都很丰富,但不同季节优势种有差异;相同季节临近位点细菌种群结构的相似性较高,且有顺河而下相近位点相似性增高的趋势。南淝河水体异养细菌数量秋季为20.3×103～616.3×103CFU/mL。冬季为2.3×103～53.6×103CFU/mL,冬季异养细菌数量比秋季低一个数量级,并且从上游到下游逐渐增多。但与其他同等富营养化水平的水体相比,其异养细菌含量较低。     

磷石膏和碱蓬对盐渍化土壤水盐及细菌群落结构的影响

盐渍土改良是农田土壤环境不可忽视的重要问题,土壤盐分的改变势必会影响土壤细菌群落.试验基于河套灌区中度盐渍土,以当地无改良措施枸杞园为对照(CK),设施加磷石膏(LSG)、枸杞间种碱蓬(JP)及施加磷石膏和枸杞间种碱蓬(LSG+JP)的改良处理,探究枸杞生育期内不同改良方式对土壤水分、盐分、养分和细菌群落结构多样性的影响.结果表明,相较CK,在开花期至落叶期LSG+JP显著降低了土壤EC值和pH值(P<0.05),平均降低39.96%和7.25%;全生育期内LSG+JP显著提高了土壤有机质(OM)和速效磷(AP)含量(P<0.05),年平均提高81.85%和203.50%;开花期和落叶期LSG+JP显著提高了全氮(TN)含量(P<0.05),年平均提高48.91%.改良初期LSG+JP的Shannon指数较CK提高了3.31%和6.54%,Chao1指数较CK提高了24.95%和43.26%;土壤优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门,优势菌属为鞘脂单胞菌属.开花期至落叶期改良处理的变形菌门相对丰度较CK增加了0.50%～16.27%,改良处理的放线菌门相对...     

崇明东滩夏冬季表层沉积物细菌多样性研究

以长江口崇明东滩高、中、低潮滩夏、冬两季表层沉积物中基因组DNA为模板,PCR扩增样品中细菌16S rRNA基因V3区片段,通过克隆、测序,构建相应基因文库.系统发育分析结果表明,崇明东滩高、中、低潮滩表层沉积物共包含12个主要门类的细菌:变形菌门(Proteobacteria)(α-、β-、γ-、δ-和ε-亚群)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿菌门(Chlorobi)、网团菌门(Dictyoglomi)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae),此外还存在大量未被认知的序列.中潮滩和低潮滩的优势菌为变形菌,高潮滩的优势菌为拟杆菌.DOTUR多样性分析结果表明,崇明中潮滩细菌多样性最高,低潮滩次之,高潮滩最低;夏季细菌多样性高于冬季.夏、冬两季细菌群落差异高潮滩最大,低潮滩次之,中潮滩最小.     

滆湖底泥细菌群落结构及多样性

2015年11月中旬采集常州滆湖底泥及水样,在滆湖水体及底泥现状分析的基础上,采用高通量测序技术对底泥细菌的16S rRNA基因进行序列测定,对底泥细菌群落结构及多样性进行研究.结果显示:滆湖水质整体呈富营养化状态,殷村港、湖北区为轻度富营养化,繁保区、塘门沟为中度富营养化.底泥细菌测得总OTUs(Operational Taxonomic Units)数为6157,多样性高.滆湖底泥细菌隶属26门38纲141属,其中以Proteobacteria、Chloroflexi、Deltaproteobacteria、Betaproteobacteria和Deltaproteobacteriawei为主,并含有少量丰度的Planctomycetacia、Alphaproteobacteria、Thiobacillus、Polynucleobacter和Geobacter等.研究发现,Firmicutes和Alphaproteobacteria丰度与富营养化指数呈显著正相关,而Betaproteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes丰度与富营养化指数呈显著负相关,即富营养化程度越高,Firmicutes和Alphaproteobacteria丰度也越大,Betaproteobacteria、Bacteroidete和Actinobacterias丰度则越小.     

石油输入对河口芦苇湿地根际微生物的影响

以辽东湾双台子河河口芦苇湿地为对象,以石油污染物作为主要的外源性污染物,采用湿地模拟实验装置进行了为期6个月的室外模拟实验,研究了石油的重要组分正构烷烃和多环芳烃在芦苇根区土壤中的时空分布及对湿地植物根际土壤微生物种群数量和群落结构的影响. 结果表明,石油污染物的输入降低了土壤的含氧量,减少了根际细菌的数量,芦苇根际细菌的数量仅为对照的1/4,同时也改变了微生物群落的优势菌群.经过6个月的含油河水灌溉后,形成了以变形菌门(Proteobacterium spp.)和拟杆菌门(Bacteroidetes spp.)为主要优势菌群的群落结构,而厚壁菌门(Firmicutes spp.)、放线菌门(Actinobacteria spp.)和蓝藻门(Cyanobacteria spp.)则受到不同程度的抑制.     

养猪微生物发酵床垫料细菌多样性分析

为揭示养猪微生物发酵床垫料细菌群落的多样性,明确发酵程度对垫料细菌群落结构的影响.本研究基于高通量测序技术分析了微生物发酵床3个发酵等级垫料的细菌群落特征.测序共获得1198467条序列,包括33个门、73纲、272科,600属的细菌,发酵床垫料细菌多样性与发酵等级相关.其中中度发酵垫料细菌数量最多,深度发酵垫料细菌种类最多.拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和厚壁菌门是优势菌类群.随着发酵等级的增加,垫料中的葡萄球菌科和皮杆菌科细菌含量减少,说明发酵床可以抑制致病菌,保护养殖健康.在3个发酵阶段,微生物发酵床中起主要降解作用的细菌不同.在轻度发酵时期,黄单胞杆菌科和间孢囊菌科细菌是主要的降解菌群;在中度发酵时期,变形菌门的腐螺旋菌科、拟杆菌门的黄杆菌科、放线菌门的棒状杆菌科和异常球菌-栖热菌门的特吕珀菌科起主要降解作用;在深度发酵时期,厚壁菌门梭菌目瘤胃菌科、拟杆菌门的紫单胞杆菌科、变形菌门的产碱菌科和假单胞菌科起降解作用.随着垫料等级的增加,粪便中的指示菌——瘤胃菌含量增加,可作为垫料更换的信号.PICRUSt分析显示随着发酵等级增加,细菌代谢水平下降.本研究可为发酵床猪粪的生物降解提供理论依据,同时为发酵床垫料的管理与维护提供参考.     

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在餐厨垃圾废水中生长条件优化

为了探讨餐厨垃圾废水用作发酵基质生产液态解钾菌肥的可行性,选用胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）作为试验菌种,采用正交和单因素方法对相关生长因素进行了优化.结果表明,在餐厨垃圾废水中培养胶质芽孢杆菌经过3 d的调整期后进入对数生长期,6~7 d时活菌数达到最大,Ⅰ类废水活菌数为1.55×1010 CFU/mL,Ⅱ类废水活菌数为6.60×1010 CFU/mL.以Ⅱ类废水为基质进行正交试验确定的较优培养条件为pH=7、温度30℃、摇床转速160 r/min、接种量2.0%（V/V）.废水的pH和盐分对胶质芽孢杆菌的生长代谢影响极为显著:最适初始pH为7（活菌数为3.80×1010 CFU/mL和9.20×1010 CFU/mL）;随着ρ（NaCl）的增加,活菌数先升高后快速降低,最适ρ（NaCl）为4 g/L.Ⅰ类和Ⅱ类废水的最佳接种量分别为1.5%（活菌数为1.60×1010 CFU/mL）和2.0%（活菌数为6.40×1010 CFU/mL）.研究显示,胶质芽孢杆菌在餐厨垃圾废水中经过培养后可达到GB 20287-2006《农用微生物菌剂》中液态菌肥的活菌数（2.0×108 CFU/mL）,经湿热处理后的Ⅱ类废水对胶质芽孢杆菌的生长有明显的促进作用.      

Succession of bacterial community along with the removal of heavy crude oil pollutants by multiple biostimulation treatments in the Yellow River Delta, China

Multiple biostimulation treatments were applied to enhance the removal of heavy crude oil pollutants in the saline soil of Yellow River Delta. Changes of the soil bacterial community were monitored using the terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and clone library analyses. The 140-day microcosm experiments showed that low C:N:P ratio, high availability of surfactant and addition of bulking agent significantly enhanced the performance, leading to the highest total petroleum hydrocarbon removal. Meanwhile, the bacterial community was remarkably changed by the multiple biostimulation treatments, with the Deltaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Acidobacteria and Planctomycetes being inhibited and the Alpha- and Beta-proteobacteria and some unknown Gammaproteobacteria bacteria being enriched. In addition, different hydrocarbon-degraders came to power in the following turn. At the first stage, the Alcanivorax-veldXed Gammaproteobacteria bacteria dominated in the biostimulated soil and contributed mainly to the biodegradation of easily degradable portion of the heavy crude oil. Then the bacteria belonging to Alphaproteobacteria, followed by bacteria belonging to Candidate division OD1, became the dominant oil-degraders to degrade the remaining recalcitrant constituents of the heavy crude oil.