16S rDNA克隆文库分析高含盐生物脱硫系统细菌多样性

采用分子生物学手段16S rDNA克隆文库方法研究连续运行1 a的生物脱硫反应器中细菌的多样性.从16S rDNA克隆文库中随机挑选40个克隆子进行序列测定(约1 400 bp),对测序结果进行了Blast对比.结果表明,脱硫系统中存在比例较高的优势菌种,有33个克隆子分属于3个不同的细菌类群,1个克隆子属于未知类群,优势细菌类群为Proteobacteria类群(变形菌类群),占85.3%.细菌类群优势顺序为:γ-Proteobacteria类群(55.9%),β-Proteobacteria类群(17.6%),Actinobacteridae类群(8.8%),δ-Proteobacteria(5.9%),α-Proteobacteria(5.9%),Sphingobacteria(2.9%).其中盐生硫杆菌属的Halothiobacillus sp. ST15和硫杆菌属的Thiobacillus sp.UAM-I是系统中的主要脱硫细菌.     

16S rDNA克隆文库方法分析好氧颗粒污泥细菌组成

采用构建16S rDNA克隆文库方法对好氧颗粒污泥的细菌种群多样性进行研究. 随机测定了82个克隆子序列(700 bp),Blast比对结果表明,好氧颗粒污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为7个主要类群,其中,β变形菌(β-Proteobacteria)类群和鞘脂杆菌(Sphingobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为34.16%和30.50%;其次是Candidate division TM7类群、黄杆菌(Flavobacteria)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群,分别为9.76%,7.32%和7.32%;放线菌(Actinobacteria)类群和α变形菌(α-Proteobacteria)类群所占比例相对较小,分别为4.88%和1.22%. 序列分析结果表明,好氧颗粒污泥中不仅含有对好氧颗粒污泥形成和稳定运行具有重要作用的食酸菌属(Acidovorax)细菌、假单胞菌(Pseudomonas)等细菌,还含有对CODCr和氨氮具有很好去除能力的Micropruina glycogenica,丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)等细菌.      

16SrDNA克隆文库方法分析MDAT-IAT同步脱氮除磷系统细菌多样性研究

采用分子生物学手段16S rDNA克隆文库方法对高效同步脱氮除磷系统MDAT-IAT(modified demand aerationtank-intermit aerationtank)的IAT池中的细菌进行了多样性研究.从16S rDNA克隆文库中随机挑选59个克隆子进行序列测定(约500bp),对测序结果进行了BLAST比对.结果表明,MDAT-IAT系统中IAT池的细菌群落具有高度多样性,有55个克隆子分属6个不同的细菌类群,3个克隆子属于未知类群,优势细菌类群为Proteobacteria类群(变形菌类群),占55.17%;细菌类群优势顺序为γ-Proteobacteria类群(34.48%)、Bacteroidetes类群(似杆菌类群,20.69%)、β-Proteobacteria类群(12.07%)、Candidate division TM7类群(12.07%)、α-Proteobacteria类群(5.17%)、δ-Proteobacteria类群(3.45%)、Firmicutes类群(厚壁菌类群,3.45%)、Candidate division OP11类群(1.72%)、Planctomycetes类群(浮霉状菌类群,1.72%).用clustalx软件从测序的58个克隆子中选出32个OTU进行系统发育分析,同样表明IAT池的细菌多样性较强.     

石油污染地下水中细菌多样性研究

采集了某废弃炼油厂的石油污染地下水样品,提取水中微生物总DNA,构建细菌16S rDNA克隆文库,并通过16S rDNA序列的系统发育分析,对样品中的细菌种群多样性以及群落结构进行了研究.结果表明,文库中阳性克隆的16S rDNA序列分属10个细菌类群,分别为γ-Proteobacteria(49.1%)、α-Proteobacteria(12.9%)、β-Proteobacteria(11.1%)、Bacteroidetes(9.2%)、Verrucomicrobia(6.7%)、Acidobacteria(2.5%)、δ-Proteobacteria(1.2%)、Actinobacteria(1.2%)、Planctomycetes(0.6%)、Unidentifiedbacteria(5.5%).在这一生态系统中,γ-Proteobacteria类细菌占据主导地位,接近50%,尤其是假单胞菌属(Pseudomonas)微生物在文库中的比例达35.6%.该石油污染地下水样品中细菌与许多其它已知的降解菌亲缘关系较近,如鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas)、红球菌(Rhodococcus)和短波单胞菌(B...     

同步硝化反硝化系统中反硝化细菌多样性研究

采用聚合酶链式反应(PCR)和分子克隆构建nirS克隆文库对同步硝化反硝化系统好氧池中反硝化细菌多样性进行了研究.从克隆文库中随机挑选75个克隆子进行序列测定,对测序结果进行了BLAST比对.结果表明,有74个克隆子分属于3个不同的细菌类群,包括β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和Uncultured bacterium. β-Proteobacteria纲为好氧池内优势菌群,占文库比例的54.41%;其次是γ-Proteobacteria纲,占文库比例的25%.对测序得到的12个OTU用MEGA软件进行系统发育分析,结果显示Thauera属为该系统中最主要的脱氮菌属.     

不同时期条纹环沟藻可培养藻际细菌研究

通过梯度稀释法分离出条纹环沟藻5个生长时期的可培养藻际细菌,利用基于单菌落16S rDNA V3区序列测定对细菌进行了分子分类鉴定,与GenBank上的相似菌株序列构建了邻接系统发育树并计算遗传距离,同时对不同时期的细菌进行了定量分析.结果表明,在分离培养出的32株细菌中,有12株不同种属细菌.12株细菌分属于a-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、g-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)4大细菌类群,在种类和数量上均以α-变形菌纲为主,其次为g-变形菌纲和拟杆菌门.每个生长时期可培养藻际细菌的种类数为5~8种,其中稳定生长期细菌种类数较为丰富,而在迟滞期和衰亡后期细菌种类较少.从各时期的细菌总数来看,对数生长期细菌数量最低,仅为2.83×106CFU/mL;在衰亡前期细菌数量最高,达到1.72×109CFU/mL;衰亡后期虽然细菌数量有所降低,但仍达到1.37×108CFU/mL.聚类分析和多维尺度分析结果显示,衰亡前期细菌群落结构与其它时期差异较大,而藻细胞快速生长阶段的对数生长期和稳定生长期菌落结构相近.衰亡前期特异性菌株鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的大量出现,可能与藻类迅速进入衰亡阶段有关;而各个时期均出现的一株麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)可能对条纹环沟藻的种群竞争起作用.在条纹环沟藻不同生长时期藻际细菌的种类与数量有所差异,藻际细菌的群落结构可能对条纹环沟藻的生长、种群竞争以及赤潮的生消具有重要作用.     

应用荧光原位杂交方法检测亚历山大藻

采用PCR方法对三株亚历山大藻核糖体DNA 大亚基部分序列和ITS区序列进行了特异性扩增和序列测定.ITS区测序及BLAST比对结果显示,三株藻类分别为塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),链状亚历山大藻(A. catenella)和微小亚历山大藻(A. minimum).在此基础上,针对中国沿海分布的有毒亚历山大藻,根据其核糖体DNA大亚基(LSU rDNA)序列信息,设计了特异性的荧光标记探针,建立了基于荧光原位杂交技术(FISH)上的有毒亚历山大藻检测方法.结果表明,探针Alexp1较理想地标记选定的目标藻--塔玛亚历山大藻(YA 藻株),经探针标记的藻细胞在荧光显微镜下可以明显区分于其他非目标藻.     

溶藻细菌BS03分离、鉴定及其对塔玛亚历山大藻生长的影响

从福建漳江口红树林区筛选出一株对产贝毒赤潮原因藻——塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamatense)具有强溶藻能力的细菌,命名为BS03,通过生理生化及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定,并探讨了菌株BS03对塔玛亚历山大藻的溶藻特性和溶藻代谢产物的初步性质.结果发现,菌株BS03属于微泡菌属(Microbulbifer sp.)相似性达99％;对塔玛亚历山大藻的杀藻效果具有一定浓度效应,在一定浓度范围内处理浓度越高,溶藻效果越好;菌株BS03对处于不同生长时期的塔玛亚历山大藻都表现出较好的杀藻效果,其中对处于延滞期的塔玛亚历山大藻表现出最佳的杀藻效果,处理96 h后,抑藻率达98.17％;不同生长期菌株对塔玛亚历山大藻溶藻作用无明显差异;菌株BS03通过间接作用方式溶藻,所分泌的胞外活性物质的分子量小于1 kDa,耐酸碱、具热稳定性,推测为非蛋白质、非核酸和非多糖类物质.     

中国东南沿海四株亚历山大藻的系统发育研究

通过核糖体基因大亚基(LSU rDNA)D1-D2区以及ITS序列分析,研究了采自于中国东南沿海的4株亚历山大藻(Alexandrium Halim)的系统发育.结果显示,本地的亚历山大藻与来自日本和韩国的藻株亲缘关系很近;而且通过构建系统发育树,发现本地亚历山大藻与东亚藻株聚成一个大族.与东亚藻株在rDNA序列上的高相似性也说明本地株亚历山大藻属于温带亚洲基因型,而从欧美传入的机会较小.结果同时显示,塔玛亚历山大藻(A. tamarense)与链状亚历山大藻(A. catenella)LUS和ITS序列相近,可能在遗传学上是同一种类.     

亚硝化/电化学生物反硝化全自养脱氮工艺细菌形态及多样性研究

采用电镜观察和分子生物学手段16S rDNA克隆文库方法对亚硝化/电化学生物反硝化全自养脱氮工艺中的细菌进行了形态和多样性研究,从16S rDNA克隆文库中随机挑选60(61)个克隆子进行序列测定(约500bp),对测序结果进行BLAST比对和系统发育分析.结果表明,亚硝化段内的细菌主要为球状和椭球状的氨氧化细菌,以亚硝酸氮作为进水基质时,电化学反硝化生物段内细菌主要为短杆状和椭球状的脱氮菌.亚硝化/电化学生物反硝化脱氮系统中蕴藏着特有的微生物新资源.亚硝化段细菌类群的优势顺序为β-Proteobacteria类群(60.00%)、Bacteroidetes类群(28.33%)和Chloroflexi类群(11.67%).当电化学生物反硝化段进水氮基质为亚硝氮(429～543mg.L-1)和氨氮(412～525mg.L-1)时,细菌优势类群顺序为β-Proteobacteria(78.33%)类群和ε-Proteobacteria类群(21.67%);当电化学生物反硝化段进水氮基质为亚硝氮(519～578mg.L-1)时,细菌优势类群顺序为β-Proteobacteria类群(81.97%)、ε-Proteobacteria(16.39%)类群和γ-Proteobacteria类群(1.64%);优势类群变化不大,但每种类群中细菌的种类和数量变化较大,这主要是由进水基质变化导致.     

海洋底栖甲藻——利玛原甲藻(Prorocentrum lima)对三种赤潮藻的化感作用

为明确利玛原甲藻(Prorocentrum lima)对其它生物可能存在的化感作用,考察了利玛原甲藻培养物、无藻细胞滤液以及腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)租提物对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋卡盾藻(Chauondla marina)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)3种赤潮藻生长的影响.结果显示,共培养时利玛原甲藻对其它3种赤潮藻的生长有不同程度的抑制作用,其生长也受到3种赤潮藻的影响;无藻细胞滤液对东海原甲藻和海洋卡盾藻有抑制作用,其中对东海原甲藻的抑制作用更明显.但对塔玛亚历山大藻的影响不大;比较而言,DSP粗提物对3种藻的影响最为明显,甚至可完全抑制海洋卡盾藻的生长.这些结果提示.利玛原甲藻与赤潮藻间存在交互抑制作用,可能会通过分泌化感物质、细胞间接触抑制等途径抑制其它藻的生长;利玛原甲藻具有一定的化感作用,但DSP毒索并非利玛原甲藻发挥化感效应的主要原因.     

Effects of UV-B radiation on the growth interaction of Ulva pertusa and Alexandrium tamarense

Enhanced UV-B(280-320nm) radiation resulting from ozone depletion is one of global environmental problems. Not only marine organisms but also marine ecosystems can be affected by enhanced UV-B radiation. The effects of UV-B radiation on interaction of macro-algae and micro-algae were investigated using Ulva pertusa Kjellman and Alexandrium tamarense as the materials in this study. The results demonstrated that UV-B radiation could inhibit the growth of Ulva pertusa and Alexandrium tamarense when they were both mono-cultured, and the growth inhibition of algae was more significant with increasing doses of UV-B radiation. Alexandrium tamarense could inhibit the growth of Ulva pertusa in mixed culture, and the growth inhibition was more significant when increasing the initial cell density. However, Ulva pertusa could inhibit the growth of Alexandrium tamarense in early phase and stimulate the growth in latter phase when they were grown in mixed culture. Lower initial cell density(10^2 cell/ml) of Alexandrium tamarense could inhibit the growth of Ulva pertusa under UV-B radiation treatment,however, with the initial cell density increasing( 10^3 and 10^4 cell/ml), the growth of Ulva pertusa was stimulated under lower dose of UV-B radiation and inhibited under higher dose of UV-B radiation by Alexandrium tamarense. Compared with that in mixed culture, Ulva pertusa showed more positive inhibition to the growth of Alexandrium tamarense under UV-B radiation treatment.     

垃圾填埋场中真细菌群落16S rRNA基因的分析

回灌式垃圾填埋场渗滤液中真细菌群落的多样性同样通过不依赖于微生物培养的分析而获得。利用特异性的引物对,选择性地扩增渗滤液DNA中的真细菌16S rRNA基因片断(16S rDNA),并用于构建16S rDNA克隆文库。文库内真细菌16S rDNA的遗传多样性通过限制片断长度多态性分析(RFLP,限制性内切酶Hin PII和Msp I)而获得。初步的结果表明,随机选出的200个真细菌克隆子被分为147个不同的RFLP型(组),当中丰度最高的两个型均仅含有9个克隆子,两者共占所有被分析克隆子的不到10%;克隆子数≥2的型共有21个(包括以上2个丰度最高的型),它们共代表74个克隆子,占所有被分析克隆子的37%;而剩下的126个型均只含有1个克隆子,它们共占整个基因文库的63%。由此可见,李坑垃圾渗滤液中的真细菌具有非常复杂的群落结构。     

Biological activity of a red-tide alga-A. tamarense under co-cultured condition with bacteria

The relationship between Alexandrium tamarense （Lebour） Balech, one of red-tide alga, and two strains of marine bacteria, Bacillius megaterium（S7 ） and B. halmapulus（ S10 ） isolated from Xiamen Western Sea, was investigated by evaluating the growth state of A. tamarense and the variation of β-glucosidase activity in co-culture system. The results showed the growth and multiplication of the alga were related with the concentration, genus speciality of the bacteria, and growth stage of the alga itself. The growth of A. tamarense was obviously inhibited by S7 and S10 at high concentration. Either inhibition or promotion contributed much more clearly in earlier than in later stageof the growth of the alga. Furthermore, there was a roughly similar variation trend of the activity of extra-cellular enzyme, β- glucosidase, in the water of the separately co-cultured bacteria S7 and S10 with the alga. The β-glucosidase activity（β-GlcA） rapidly increased during the later algal growth accompanying the increase of the lysis of the alga cells. The obvious inhibition of A. tamarense by marine bacteria at high concentration and evident increase of β-GlcA in co-colture system would help us in better understanding the relationship between red-tide alga and bacteria, and also enlightened us the possible use of bacteria in the bio-control of red-tide.     

Variations of dominant microbial populations in groundwater in response to the leachate from Laogang Landfill

Temporal changes of dominant microbial populations in groundwater in response to the leachate from Shanghai Laogang Landfill were investigated. Concentrations of dissolved redox-relevant species in groundwater suggested that the dominating redox process had changed from denitrification to methane-production/sulfate-reduction due to landfilling. Dominant microbial populations were determined using restriction fragment length polymorphism(RFLP) analyses of 16S rRNA gene libraries, which were further studied by sequencing and phylogenetic analyses. The results indicated that obvious shifts of dominant microbial populations had occurred in groundwater in response to the pollution of leachate. The closest relatives of some dominant clones are accordant with the dominating redox processes determined by hydrochemical analyses, based on the GenBank‘s indications on the ability to perform redox reactions.     

氮、磷限制对塔玛亚历山大藻细胞周期及毒素含量和组成的影响

优化了塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense CI01细胞同步化方法,研究了N、P限制对A.tamarense CI01细胞周期及毒素含量和组成变化的影响。结果表明,采用前期驯化、细胞沉降分离和光限制诱导相结合的同步化方法,细胞同步率提高了约14%。N、P限制条件下,细胞分裂受抑制,分别停滞于G2/M期和G1期。营养盐对毒素合成及组成影响比较明显:N限制下单细胞毒素含量降低,P限制下单细胞毒素含量升高。在正常营养和P限制条件下,C1,2占毒素总量的98%以上,GTX2,3占总毒素量的2%左右;N限制条件下,C1,2所占比例下降到90%左右,而GTX2,3比例增长到约10%。根据C1,2和GTX2,3在一个细胞周期内的变化规律推测,毒素的合成受光诱导并在细胞周期G1期的特定时间内合成,细胞可能先合成GTX2,3毒素,后被转化为C1,2毒素。     

生活垃圾厌氧堆肥产甲烷及古细菌多样性分析

通过厌氧堆肥试验,对厌氧堆肥产甲烷的基本特征进行了研究,结果表明:在厌氧堆肥开始阶段,气体中只有8%的甲烷,二氧化碳产率是甲烷产率的4倍左右;而随着反应的进行,二氧化碳产率呈下降趋势,甲烷产率逐渐升高,并于3个月时达到最高值45%;此后二氧化碳及甲烷产率都逐渐降低。对3个月时的垃圾堆肥渗出液取样,提取总DNA,对古细菌片段进行限制性片段长度多样性分析(RFLP),在60个随机选出的古细菌rDNA克隆子中,可以划分15个不同的谱型。对深入了解产甲烷厌氧微生物过程,加快垃圾稳定化具有重要意义。     

桉木粉对塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）的抑制作用及其化学基础研究

摘要：探讨了托里桉(Eucalyptus torelliana)、尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、窿缘桉(Eucalyptus exserta)等3种桉木粉对塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）生长的影响,并对其抑制赤潮藻类生长的化学基础进行了初步研究,以期为新除藻剂的筛选提供参考和依据。结果表明,不同桉木粉对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用不同,托里桉木粉的抑藻作用明显强于尾叶桉和窿缘桉。灭菌与非灭菌托里桉木粉对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用差别不大,提示细菌等微生物并非木粉抑藻的主要原因。不同溶剂粗提物对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用不同,丙酮-水粗提物的抑藻活性明显强于乙酸乙酯、甲醇和水粗提物。进一步将丙酮-水粗提物分成A、B、C和D等4个组分,比较不同组分的抑藻活性。结果发现,丙酮-水粗提物中D组分的抑藻作用最强。该组分浓度为3 mg/L时,3 d时对塔玛亚历山大藻的去除率可达81.06 %。GC-MS分析表明,D组分中含有4-羟基-3,5,6-三甲基,1-4[(1z)-3-氧代-1-丁烯基]-2-环已烯酮和4,4,7a–三甲基,5,6,7,7a-四氢-2(4H)-苯并呋喃酮等酮类物质。这些结果表明,托里桉木粉可显著抑制赤潮藻的生长,其中存在的酮类化感物质可能是其抑制藻类生长的主要原因。     

全程自养脱氮系统中氨氧化菌关键种群的变迁

全程自养脱氮是在高铵氮低溶氧条件下完全由自养菌群作用而将水中氮素脱除的现象。特异性扩增16SrDNA上的氨氧化菌特异的CTO基因片段,建立克隆文库并进行系统发育学分析,考察全程自养脱氮系统菌群驯化及退化过程中氨氧化菌的结构组成和其中关键种群的变迁,结果表明:在驯化过程中Nitrosospira属细菌和Nitrosomonas oligotropha细菌逐渐被能够耐受高氨氮低溶氧的Nitrosomonas europaea细菌所代替,后者可能是全程自养脱氮系统氨氧化步骤的主要参与者,而氨氧化菌的菌群演变可能并不是后来系统退化的原因。