龙眼miR159家族成员进化特性及时空表达

为了解植物miR159家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达规律,以龙眼miR159家族为例对miRNA家族进行探讨.通过龙眼miR159家族前体与成熟体序列比对、前体二级结构预测、系统发育进化树的构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对龙眼miR159基因家族进行研究.结果显示:龙眼miR159家族存在7个前体成员和6个成熟体成员,序列比对发现5个成熟体可以高度定位于7个前体序列中一个共有的、约20个碱基的保守区域,推测miR159成熟体主要来源于该区域;进一步分析发现6个成熟体序列中仅2个可定位于pre-MIR159中.mfold预测结果显示miR159家族7个前体的最小折叠自由能在-56.54--92.53 kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构.系统发育进化树显示龙眼miR159家族前体与成熟体成员均具有保守性与多样性.靶基因预测发现龙眼miR159家族所有成员共预测出14个不同靶标,其中3个成员也可以作用于同一靶标.实时荧光定量PCR显示,龙眼pre-MIR159家族成员间在不同组织部位表达量差异显著,但表达趋势却几乎一致,其中花器官中表达量最高,提示了dlo-miR159在生殖器官形成过程中具有重要的作用,尤其是在雄花中作用显著.本研究表明龙眼miR159家族在进化过程中形成了保守性与多样性并存的进化特性,并且可能在花器官形成过程中发挥了重要的作用.     

龙眼miR156家族及其调控靶标SPL的生物信息学和表达模式

为了解miR156基因家族的进化特性及其在龙眼早期体胚发生过程中的调控作用,对植物miR156家族成员的成熟体和前体序列进行多重比对和进化特性分析,并对龙眼miR156基因家族成员进行了前体(pre-miRNA)二级结构预测、靶基因预测及裂解位点验证,利用qPCR技术探究龙眼体胚发生早期miR156a与靶基因SPL6/9/16调控模式.结果表明,龙眼miR156家族含有13条成熟体序列和6条前体序列.Mfold预测显示,pre-miR156家族6个成员的序列均能形成典型稳定的茎环二级结构,它们的最小折叠自由能(ΔG)在-43.30--62.60 kal/mol;成熟序列的碱基保守性高.系统发育进化树分析显示,龙眼miR156家族与水稻、拟南芥的miR156亲缘关系更为接近.靶基因预测显示,龙眼miR156a的靶基因是SPL2、SPL6、SPL9、SPL16、SPL18;利用改良的RLM-RACE在龙眼愈伤组织中检测到SPL6/9/16的断裂片段,miR156a在与靶基因mRNA互补的第10个核苷酸处切割靶标mRNA.实时荧光定量PCR显示,在龙眼体胚发生早期miR156a在0-9 d表达平稳,仅在球形胚(globular embryos,GE)阶段显著下调,SPL6/9/16表达量持续上调,在GE阶段表达量最高,提示SPL6/9/16的大量积累对龙眼球形胚形态建成具有重要作用.本研究表明植物miR156基因家族成熟体序列高度保守,且miR156a的下调表达与靶基因SPL6/9/16的大量积累可能对龙眼球形胚的建成具有重要意义.(图7表2参22)     

植物miR408家族的进化与分子特性

miR408家族在植物上已有报道,但其进化规律与分子特性研究很少.利用miRbase数据库提供的34种植物49个miR408的前体序列和64个成熟体序列,采用分类统计、进化树构建、序列比对、二级结构预测、染色体定位分析及靶基因预测等手段,进行进化规律与分子特性分析.结果显示:miR408家族成员分布在34个植物物种中,分布较为广泛,并且苔藓类植物可能是植物miR408家族进化的祖先;物种特异性是影响miR408前体进化特性的重要因素,而序列保守性是影响成熟体进化特性的主要因素;由5p臂上形成的miR408成熟体的序列特异性较大,由3p臂上形成的miR408成熟体的序列保守较高;Mfold预测表明植物miR408家族具有典型的茎环二级结构,茎序列的保守性高于环序列,3p臂上茎序列的保守性高于5p臂上茎序列;靶基因预测表明miR408广泛参与植物生长发育和逆境胁迫的应答.综上表明植物miR408家族成员在进化过程中保守性与特异性并存,这对进一步研究植物miR408的生物学功能具有参考价值.     

龙眼Hsf基因家族全基因组鉴定及体胚发生过程中的表达分析

基于龙眼基因组数据库对龙眼Hsf(DlHsf)基因家族进行全基因组鉴定,并对其基因结构、启动子作用元件和CpG岛分布情况、编码蛋白的理化性质和进化情况以及它们在不同体胚发生阶段和不同组织器官的表达情况进行研究,同时对靶定DlHsf的miRNA进行预测分析.结果表明:DlHsf基因家族共20个成员,基因结构高度保守.它们编码的蛋白具有典型的DNA结合域(DBD),且均为不含信号肽的不稳定蛋白.启动子分析发现,该基因家族成员的启动子除典型的热激元件(HSE)外,还含有MYB元件等与逆境胁迫及生长发育相关的元件,DlHsfA1d、DlHsfA9a、DlHsfA9b和DlHsfC1启动子存在典型的CpG岛.进化树分析表明DlHsf可分为DlHsfA、DlHsfB和DlHsfC三类. qRT-PCR结果表明,DlHsf在胚性阶段(EC)和球形胚阶段(GE)表达量较高,在不完全胚性紧实结构阶段(ICpEC)表达量较低,在龙眼体胚发育过程中呈现"V"状趋势,表明DlHsf可能主要在EC、GE阶段发挥作用.此外,DlHsf家族成员在花芽和花蕾中表达量较高,其次是在果肉中,推测DlHsfs可能与龙眼花发育等生长过程相关. psRNA Target预测结果表明DlHsf基因家族受到miRNA调控,且调控方式多样.本研究表明DlHsf功能多样,可能在龙眼生长发育、胁迫响应、DNA甲基化、组织器官特异表达等生物学过程中发挥作用.(图8表5参38)     

高效固氮大豆根瘤菌SMH12的全基因组测序及比较基因组分析

费氏中华根瘤菌SMH12(Sinorhizobium fredii SMH12),生长代时较短,属于快生型大豆根瘤菌. SMH12具有高效固氮、宿主范围广、匹配性强、遗传物质稳定等特点,为充分开发该菌应用潜力和研究价值,有必要解析SMH12的基因组序列.采用Illumina Hiseq与Pacbio测序技术相结合对SMH12菌株进行全基因组测序.进一步使用相关软件对测序数据进行基因组的组装、基因预测与功能注释、COG/GO聚类分析以及比较基因组分析.测序结果显示,SMH12基因组包含1条染色体和2个质粒,染色体大小为4 022 924 bp,质粒pSfSMH12a大小为2 394 395 bp,质粒pSfSMH12b大小为556 376bp,序列已提交至GenBank数据库,登录号为CP035038-CP035040.基因预测与rRNA、tRNA查找显示,SMH12基因组含有6 836个基因,有9个rRNA和55个tRNA.比较基因组分析的直系同源基因比对与共线性分析显示,SMH12与S. fredii HH103大部分基因相同,亲缘关系最密切;只有约17%的基因不同.COG分类比较分析显示,SMH12中转座因子和碳水化合物的转运与代谢这两类相关基因的占比明显高于Bradyrhizobium diazoefficiens USAD110.本研究首次报道SMH12基因组序列并分析了其基因组基本特征,与其他代表性大豆根瘤菌进行了比较基因组分析.结果丰富了根瘤菌基因组数据库,也为构建高效固氮的大豆根瘤菌工程菌提供了一定依据和基因资源.(图6表2参35)     

eTM、microRNA319及其调控靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式

MicroRNA319作为最保守的miRNA家族之一,在植物器官形态建成、激素信号转导、抵抗外界胁迫等途径中均有重要作用.为了解miR319在植物体胚中的调控途径,利用龙眼转录组数据库筛选miR319成熟体(miR319)和前体序列(pre-miR319),并通过DNAMAN 6.0和Mfold分析miR319的定位和pre-miR319的二级结构;进而采用TAPIR和psRNAtarget预测选定的miR319成员的内源诱捕靶标(endogenous target mimics,eTM)及候选靶标,并通过RLM-RACE验证靶标裂解位点,最后分析eTM、miR319及其靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式.结果显示,龙眼4个miR319成员有1个定位于miR319a scafflod517,有3个定位于miR319a scaffold225.因此,以miR319a scaffold225为研究对象,将其命名为pre-miR319a,其上的成熟体分别命名为miR319a-3p.1、miR319a-5p.1和miR319a-5p.2.裂解位点显示龙眼miR319a 3个成员中,miR319a-3p.1的靶基因为TCP2和TCP4(Dlo_022819.1,Dlo_026743.1),miR319a-5p.1的靶基因为吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGS)和ABI3-5抑制因子,miR319a-5p.2未验证到靶基因.qPCR显示,在龙眼早期体胚发生过程中,miR319a 3个成员的表达模式基本一致,呈显著上调趋势.另外,除eTM8637外,其余eTM的表达模式与其相应的miR319a成员基本呈现为负相关趋势,均为下调趋势. miR319a-3p.1与其靶基因基本呈现为负调控趋势,miR319a-5p.1与ABI3-5抑制因子在龙眼早期体胚发生后期呈现负调控,与IGS没有明显负相关.本研究初步验证了"eTM-miR319a-靶基因"信号途径可能参与到龙眼早期体胚发生的形态建成.(图4表3参46)     

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶(DlLAC)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示:DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.     

龙眼miR167家族分子特性及其潜在靶标在体胚发生早期的表达模式

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3’端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.(图9表3参54)     

文心兰15个miRNAs及其候选靶标的表达特性

为了解miRNAs及其候选靶标在文心兰不同组织部位及假鳞茎受软腐病病原菌侵染中的表达规律,基于文心兰转录组和miRNA数据库进行分析,从中筛选获得15个miRNAs,结合生物信息学法对其候选靶标进行预测和功能注释,并利用实时荧光定量技术检测miRNA及候选靶标在文心兰不同组织部位和假鳞茎受软腐病病原菌侵染的表达情况.结果表明,文心兰miRNA数据库的miRNA reads分析提示15个miRNAs不同成员可能在文心兰正常植株和感病不同阶段中差异表达. psRNATarget靶标预测显示,文心兰15个miRNAs有828个候选靶标,其中67个可能与抗病相关,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白、F-box蛋白基因、锌指蛋白、RGA抗病蛋白等.基于文心兰miRNAs读取次数(Reads)和Unigene候选靶标RPKM值,发现miRNAs及其候选靶标在文心兰正常植株和假鳞茎不同感病时段表达均存在差异.实时荧光定量PCR分析显示,在文心兰不同组织部位中,miR159a、miR167b、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a均在假鳞茎和叶中均大量表达,并与对应候选靶标的表达呈负调控关系,推测它们参与假鳞茎和叶的发育和形态建成.在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎中,miR159a、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a在8 h处理时表达量高,并且与对应的候选靶标在侵染0-8 h表达呈负调控关系,推测上述miRNAs通过负调控候选靶标在中期响应软腐病病原菌侵染过程;而miR167b在处理0h高表达,并且与候选靶标在侵染0-8h表达呈负调控关系,推测其通过下调表达参与软腐病病原菌侵染过程的响应.上述研究表明,文心兰miRNAs通过介导候选靶标的裂解可能广泛参与文心兰不同组织的发育及软腐病病原菌侵染过程的响应.     

砷对绿藻的毒性效应及氧化还原条件的影响

选择绿藻中耐毒品种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为研究对象,分析三价砷加入对其体系氧化还原条件的影响,研究代表性绿藻莱茵衣藻C.reinhardtii对水体三价砷毒性的响应.结果表明,光照或黑暗条件下莱茵衣藻C.reinhardtii的生长都会使pH升高,氧化还原电位(Eh)减小.根据pH-Eh分析可知,水体三价砷As(Ⅲ)大部分以H_2AsO_3~-存在,H_2AsO_3~-加入后pH升高和Eh减小趋势更为明显,并随其浓度增大,Eh会出现缓慢上升趋势.同时,pH与Eh变化也会影响砷对藻类的毒效应,当pH值为10.0—10.5,Eh为-143—-136 mV时,三价砷浓度增大对藻类生长速率没有明显影响,但当pH值为9.5—10.1,Eh为-156—-143 mV时,三价砷浓度增大会明显降低了藻类生长速率.     

F~-和Cl~-对莱茵衣藻的生长效应

为了探讨和比较F-和Cl-对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)生长的抑制毒性,采用锥形瓶培养法及模型分析,研究了不同浓度F-和Cl-胁迫下莱茵衣藻生物量、比生长速率及生长抑制程度的变化。结果表明:5~80mg·L-1的F-对莱茵衣藻均具生长抑制毒性,且抑制率随F-浓度和暴露时间的增加而增大,但10 d最大抑制率低于62%,因此,莱茵衣藻对80 mg·L-1以下的F-具有较好的耐受性;Cl-对莱茵衣藻的生长既有促进作用,甚至也有严重的抑制作用(12 800 mg·L-1Cl-处理组10 d抑制率可高达96%),这取决于Cl-浓度;F-和Cl-对莱茵衣藻的生长效应不同,主要表现在生长效应模型系数随F-和Cl-浓度的变化规律上。另外,就相同暴露时间下的EC50值而言,F-(18.0~56.4 mg·L-1)远低于Cl-(1 074~2 630 mg·L-1),即F-对莱茵衣藻的毒性高于Cl-,但Cl-的生态风险亦不容忽视。     

人类转录因子样新基因TFL76的初步研究

运用基于基因组数据库特定基因同源基因的克隆策略得到人类新基因TFL76 ,它编码 12个C2 H2 型锌指基序 .其cDNA序列长 2 2 6 8bp,预测的编码蛋白含 6 77个氨基酸 ,分子量 (Mr)为 76× 10 3 .生物信息学分析表明 ,TFL76的N末端含有多种蛋白激酶的磷酸化位点和核定位信号 ,具有转录因子的特征 .染色体定位为 19q13.4 ,此位点存在很多与癌症相关的基因 .对 9.5d和 10 .5d的鼠胚进行全胚原位杂交 ,结果表明 ,此基因在前肢芽和后肢芽表达较高 .图 5表 1参 5     

莱茵衣藻胞外聚合物的提取和红外光谱表征

胞外聚合物(EPS)是微生物细胞代谢过程中产生的高分子物质,其中的多种官能团通过络合、转化等反应改变周围环境的元素形态和活性,在污染生物修复中具有应用前景.以模式微藻——莱茵衣藻为研究材料,采用加热法、NaOH法、EDTA法、阳离子交换树脂(CER)法、高速离心法提取莱茵衣藻的EPS,比较分析每种方法得到的EPS的含量及其组成成分,并结合LIVE/DEAD BacLight染色和激光共聚焦显微镜观察细胞活性,以确定莱茵衣藻EPS最适宜的提取方法.结果表明,不同提取方法得到的EPS各组分含量有显著差异,5种方法的提取总量依次为NaOH法加热法CER法EDTA法离心法.荧光染色和激光共聚焦显微镜检测结果表明,相对于NaOH法,加热法对微藻细胞的破坏程度较小,且傅里叶红外光谱分析结果表明,加热法提取的EPS出现N-H、C=O或C-N(蛋白质)和C-H、C-O-C、RHC(OH)(OR)(糖类)等吸收峰.本研究表明加热法是莱茵衣藻EPS的最适宜提取方法,EPS的官能团信息sk可为后续研究莱茵衣藻EPS与重金属之间的相互作用奠定基础.     

34株假单胞菌的泛基因组分析

假单胞菌属在各种环境广泛分布且具有重要的生态应用价值,然而当前研究对其环境适应性遗传基础的解析尚不充分.选择33株有效发表且具有全基因组序列以及一株新分离的假单胞菌的全基因组进行泛基因组学分析.结果表明,选择的假单胞菌属菌株泛基因组含有173 271条蛋白序列,共有30 847个同源基因家族,包括1 505个核心基因,基因组呈开放型.通过分析不同基因组的基因组演化特征,发现通过基因水平转移获得的基因占整个基因组的比例为32%-48%,其平均基因岛数量为53个.发现假单胞菌属泛基因组的开发性与其频繁的基因水平转移事件和快速的基因进化有关.进一步分析表明,不同基因组中的功能基因家族按照菌株的环境分布进行聚类,表明对特殊环境的适应决定了假单胞菌的遗传特征.本研究初步揭示了假单胞菌属细菌遗传特征的共性与特性,结果可为解析假单胞菌属环境适应性的遗传基础与功能多样性的演化发生机制提供研究线索.(图8表1参37)     

中华猕猴桃‘红阳’Alase家族基因的克隆及表达分析

在高等植物中醛糖酸内酯酶(Alase)催化L-半乳糖酸(L-Gal A)形成抗坏血酸(Ascorbic acid,As A)的前体物质L-半乳糖-1,4-内酯(L-Ga IL),是As A合成分支途径D-半乳糖醛酸途径中的关键步骤.基于最新的猕猴桃基因组数据库,分离并克隆到3个Alase家族基因,分别命名为Alase1、Alase2、Alase3,并从基因信息、蛋白质理化性质、二级结构及序列特征方面对其进行预测及分析.结果表明,Alase为亲水性蛋白,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,3个Alase基因具有高度的相似性.定量RT-PCR分析表明3个Alase家族基因在不同组织中均有表达,且在成熟的叶片中表达量最高.同时在猕猴桃果实发育及成熟过程中,Alase家族基因在幼果中的表达水平较低,而在果实发育后期及果实成熟过程中表达量不断升高.本研究可为Alase家族基因后续功能研究及猕猴桃中As A生物合成和积累分子机制解析奠定基础.     

一种羟胺氧化酶基因序列的PCR扩增及其生物信息学分析

采用PCR法获得不动杆菌Acinetobactor sp.YY-5的一种羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidoreductase,HAO)编码基因序列并进行生物信息学分析.根据自养菌的HAO基因序列保守区设计4对引物,通过RT-PCR获得预期大小的部分序列,再采用Genome walking PCR法向所得的部分序列两侧延伸;对所得序列在NCBI中进行blast分析,并用FGeneSB进行开放滨码框(Open read frame,ORF)预测.结果表明,RT-PCR获得了一段462 bp的序列,通过Genome walking PCR向两侧延伸后,获得了一段3 152 bp长的序列;ORF预测结果显示所得序列可能有4个ORF,RT-PCR获得的462 bp序列所在ORF长555 bp,对应氨基酸序列相对分子质量(M)大小为20.2×103;在Genebank中进行的Blast比对分析显示,除保守区的引物序列外,未发现有与此ORF存在明显相似性的HAO基因,表明这可能是一种新型羟胺氧化酶基因.图5表3参14     

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉(Musa itinerans)叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大(57-226 nt);miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.     

RNAi技术及其在植物中的应用研究进展

RNA干扰（RNA inteffemnce，RNAi）是由双链（double-stranded RNA，dsRNn）所引起的序列特异性基因沉默。是真核生物中一种非常保守的机制．RNA干扰依赖于小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）与靶mRBA之间的严格碱基配对，具有高度特异性．本文就RNM的发现、作用机制研究、特点、以及在植物功能基因分析、抗病毒与品种改良等方面的应用进行了综述，并对存在的问题和应用前景作了分析和预测．     

西番莲查尔酮合成酶(CHS)基因家族全基因组鉴定及表达模式北大核心CSCD

为了解西番莲(Passiflora edulis Sims f.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因家族的分子进化特性及其在果皮着色与非生物胁迫中的功能,从Pfam数据库下载CHS蛋白HMM模型,并使用HUMMER 3.0、Blast工具和CDD-search鉴定出西番莲基因组中的CHS基因.采用TBtools、EXPASy、MEGA 7.0、MEME、PRAB、SWISSMODEL和PlantCARE等软件对其氨基酸与碱基序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR的方法检测西番莲CHS(PeCHS)基因家族成员进行表达模式分析.研究结果显示西番莲基因组中共有11个PeCHS基因家族成员,分布在6条染色体上,可分为4个亚族,基因结构分析显示2个PeCHS(PeCHS5和PeCHS9)基因具有3个外显子,其他PeCHS基因只具有2个外显子.西番莲物种内共线性分析结果显示两个PeCHS基因对具有片段重复特征:PeCHS3-PeCHS6和PeCHS7-PeCHS9.多物种共线性分析结果显示,只有PeCHS10基因与其他物种具有进化关系.启动子顺式作用元件分析表明该基因家族成员启动子上含有大量逆境胁迫和激素、响应元件.qRT-PCR结果显示PeCHS基因在紫色果皮中的表达量明显高于黄色果皮,且大部分PeCHS基因的表达量在紫色西番莲果皮转色后显著增加.此外,分别有5个(PeCHS3、PeCHS4、PeCHS6、PeCHS8、PeCHS10)和6个(PeCHS1、PeCHS3、PeCHS4、PeCHS7、PeCHS8、Pe CHS11)基因的表达量在高温与低温胁迫下显著提高.本研究表明西番莲的CHS家族成员序列相对保守,并且部分成员可能在果皮花青素积累与温度胁迫中发挥重要作用.(图10表4参53)     

大气污染物复合暴露后血浆microRNA芯片分析

随着miRNAs在循环系统中被检测出来,血浆miRNAs可以作为临床疾病早期诊断的生物标记物.为了探究交通和煤炭工业源大气污染可能对中枢神经系统产生的不良影响,本研究通过建立小鼠SO_2、NO_2及PM_(2.5)复合染毒模型,利用miRNAs芯片技术发现复合暴露后小鼠血浆中发生明显变化的miRNAs,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法验证芯片结果,使用miRanda、miRDB、miRWalk及Targetscan软件对发生明显改变的miRNAs进行靶基因预测,分析靶基因富集的基因功能(Gene ontology,GO)和信号通路(Pathway).结果提示,SO_2、NO_2及PM_(2.5)复合染毒可诱导小鼠血浆miRNA表达谱发生明显改变,低浓度暴露组与对照组相比共有19个miRNAs上调,7个miRNAs下调,高浓度组有64个上调,8个下调(变化倍数大于2),选择在两个浓度处理组中变化倍数均为最大的miR-144-3p及miR-122-5p用于生物信息学分析.qRT-PCR结果表明,miR-144-3p及miR-122-5p变化趋势与芯片一致.生物信息学分析显示差异表达miRNAs所调控的靶基因明显富集于30个GO(包括中枢神经系统发育、树突棘和神经棘等)和2条信号通路(轴突导向和癌症通路),揭示了差异表达miRNAs可能通过调控靶基因参与复合暴露介导的中枢神经系统发育.