铁皮石斛外源lea3基因的转化及耐盐性分析

利用基因枪法将来源于大麦(Hordeum vulgare L.)的抗旱耐盐基因lea3导入铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)的类原球茎(PLBs)中,经膦丝菌素类除草剂PPT筛选2次获得抗性PLBs,于无选择压下分化获得不定芽,再经PPT筛选和生根壮苗培养获得转化植株.对转化植株进行除草剂PPT叶片涂抹检测和lea3基因的PCR检测,表明lea3基因已整合到6个株系7株铁皮石斛转化植株基因组中,转化频率为1.05%.与对照相比,获得的转基因植株的耐盐胁迫能力明显增强,表明遗传转化lea3基因可用于石斛抗旱耐盐新品种的选育.     

麻疯树成熟胚乳再生植株及其气孔分析

对麻疯树成熟胚乳进行组织培养获得胚乳再生植株,并对其气孔进行分析.麻疯树成熟胚乳在25℃、12 h光照条件下培养7 d愈伤组织诱导完成,2,4-D浓度为2.0 mg L-1的MS培养基愈伤诱导效果最好,诱导率达89.29%.愈伤组织在含BAP的改良培养基上培养至黄绿色后转入分化培养基,在含IAA 0.25 mg L-1和ZT 1.5 mg L-1的WPM培养基上不定芽分化率达32.50%.将分化的不定芽从愈伤组织上剥离后转入含IBA、BAP和GA3的培养基上进行芽伸长培养.取胚乳不定芽叶片接种在含IBA 0.1 mg L-1、BAP 0.5 mg L-1和TDZ 0.5 mg L-1的MS培养基上诱导生芽后,再转入含IAA 0.25mgL-1、KT 0.5mg L-1、BAP 1.0 mg L-1和GA3 0.25 mg L-1的培养基上进行丛生芽的诱导,成芽率为85.2%.这些芽在含0.1 mgL-1 IBA的1/2 MS培养基上生根,大约有37.5%的芽生了根,平均有5.2条根系形成.与母本植株相比,再生的胚乳植株保卫细胞更大,且气孔密度减小.图2表6参24     

青蒿无性系中青蒿素生物合成的相关因素

通过诱导丛生芽的方法得到青蒿高产无性克隆系S1,并用S1进行了青蒿素生物合成相关因素的研究 .发现在Hoagland培养液中添加 0 .4 4mg/L浓度的ZnSO4或者 5 .72mg/L的HBO3 时 ,能有效提高青蒿素的含量 .研究表明 ,青蒿素含量和青蒿各株系间的遗传差异存在很大关系 ,RAPD分析的结果表明 ,用OPA15能够在青蒿高产株系中扩增到OPA15 10 0 0 这一特异性片段 .另外 ,对青蒿素含量和青蒿生殖生长关系的研究表明 ,青蒿素含量最高的发育时期是现蕾期 .图 7表 1参 19     

转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)抗虫甜椒植株的获得

以12－14d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体，经根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（sck）导入甜椒杂交种“中椒5号”和常规种“茄门”中，在对甜椒转化系统和芽丛诱导茎伸长的条件进行优化研究后，获得了卡那霉素抗性植株，最高转化率为16．7％，卡那霉素抗性筛选、PCR检测和Southern blot杂交均证实，nptⅡ基因和sck基因整合进甜椒基因组中，室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明，转基因植株对铃虫（Heliothis armigera Hubner）具有一定抗性。     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

菊花组培快繁技术研究

以菊花嫩茎段为材料,进行无菌系建立、芽分化、生根等试验,探讨菊花组培快繁技术.结果表明:(1)以MS BA2.0 mg.L-1 NAA0.1 mg.L-1(单位下同)为培养基,分别置于普通培养室(不开灯,200~500 lux)与人工气候箱中培养,在前者条件下基本上不诱导芽的形成,25天后有部分黄白色愈伤组织形成;而在人工气候箱中培养则产生丛生芽,每茎段在30 d后可形成8~10个丛生芽.(2)分别以①MS BA1.0 NAA0.1,②MS BA2.0 NAA0.1,③MS BA3.0 NAA0.1为增殖培养基,培养25 d后芽增殖3.65~5.90倍.(3)在a.1/2MS NAA0.2;b.1/2MS IAA0.2;c.1/2MS IBA0.2共三个培养基中进行生根培养,生根率均达100%,但前两个培养基中长出的根系细长、数量少,而后一个培养基则根系粗短、数量多.     

根癌农杆菌介导的高赖氨酸蛋白基因转化叶用莴苣的研究

构建了植物表达载体pLBI，该载体携带35S启动子、高赖氨酸蛋白基因(LRP)、NPTⅡ基因和NOS终止子，对影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens L.)转化的多种因素进行探索后，建立了一种农杆菌介导的稳定的叶用莴苣遗传转化系统．选择目前生产上大量推广应用的叶用莴苣品种，以其无菌苗子叶为外植体，经农杆菌LBA4404(含质粒pLBI)感染，在含ρ(Kan)／mgL^-1=100的芽分化培养基上筛选转化芽，转入含相同浓度抗生素的生根培养基上进行生根筛选，直至得到完整的再生植株．PCR扩增及Southern blot的检测结果均表明，高赖氨酸蛋白基因已整合到叶用莴苣基因组中．图4表4参6     

绿萍LmPDS基因RNAi载体的构建及遗传转化

PDS基因编码控制类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶,其被沉默或抑制性表达会使叶片组织出现斑驳、黄化、白化的现象.构建绿萍(Lemna minor)LmPDS基因RNAi载体及完成遗传转化研究,对于实现RNAi技术在绿萍中的应用具有重要意义.选取595 bp LmPDS基因片段为干涉片段,利用中间载体pUCCRNAi将克隆的LmPDS干涉片段正反向插入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCST中.将成功构建的RNAi载体通过农杆菌介导法转入绿萍愈伤,经愈伤抗性筛选、植株再生、植株扩培、标记基因NPTII检测等过程,获得植株70株,其中4株为转基因阳性植株.再经荧光定量PCR分析、番茄红素含量检测、表型观察转基因植株.结果显示,转基因阳性植株LmPDS相对表达量明显下降,为对照的28.8%-40.5%,其番茄红素含量也明显下降,且叶片出现了明显的白化表型.本研究成功构建绿萍LmPDS基因RNAi载体,实现了RNAi在绿萍中的应用,结果可为进一步的绿萍基因功能研究提供材料和方法.(图11表1参30)     

青蒿试管苗开花及用花器官为外植体诱导丛生芽生产青蒿素

将培养于MS培养基上5wk的青蒿试管苗置于光周期13，光强6000lx，温度为26℃（昼）和22℃（夜）的条件下，成功地诱导其开花，利用不同发育阶段的花蕾和花器官为外植体诱导丛生芽，发现不同浓度（ρ）的6－BA对丛生芽的诱导率和青蒿素的生物合成有重要影响。结果表明：以花蕾为外植体诱导丛生芽的最佳培养基是：MS附加4.0mg L^-1的6－BA和0.05mg L^-1的NAA；但当ρ（6－BA）在0－0.5mg L^-1之间时，有利于青蒿素的合成ρ（6－BA）=0.5-4mg L^-1时抑制青蒿素的生命合成，丛生芽中促进青蒿素合成的最佳ρ（6－BA）为0.5mg L^-1，用HPLC法测定发现用此法得到的丛生芽青蒿素的含量比直接利用叶片诱导的丛生芽青蒿素含量高1倍。     

高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化

以生菜(LactucasativaL.)为受体材料,将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体pLBI用农杆菌介导法进行遗传转化,获得47株转基因生菜植株.PCR和Southern-blotting检测证实目的片段在T0代的整合,RT-PCR检测表明目的基因的转录.T0代植株赖氨酸(Lys)含量的测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,比对照提高最高的可达9.46%.T1代植株PCR检测证明,目的基因能够遗传.图5表1参25     

中药青蒿的生理生化特征及其研究进展

中药青蒿即黄花蒿 (ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ .) ,与分类学上的青蒿 (Ａｒｔｅｍｉｓｉａａｐｉａｃｅａ)同属菊科 (ＡｓｔｅｒａｃｅａｅｏｒＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ)蒿属(Ａｒｔｅｍｉｓｉａ) ,两者均为一年生草本植物且形态上非常相似 ,最明显的区别是黄花蒿的叶片为三回羽状全裂 ,而青蒿为二回羽状全裂 .青蒿广泛分布于全国各地 ,多生于海拔 40 0ｍ以下的丘陵平地[1] .现在这种植物广泛分布于世界各地[2 ] .青蒿在许多地区被用于编制花环 ,提取香料 ,更重要的是从青蒿中分离出的青蒿素是所有抗疟药中起效最快、疗效最好、毒性最低…     

水浮莲(Pisia stratiotes Linn.)的体外再生与繁殖

建立了水生单子叶植物水浮连(Pistia stratiotes Linn.)通过器官发生途径的体久高效再生与繁殖方法.采用叶、茎节和匍匐茎为外植体诱导愈伤组织,只有茎节能够在添加2,4-D和6-BA的MS基本培养基上形成合愈伤组织,而叶和茎在含有不同组合植物激素的培养基上都不能够诱导愈伤产生.将愈伤组织转到添加6-BA和NAA的MS固体分化培养基可以在2wk内形成小苗,将小苗移至含NAA的MS固体生根培养基形成完整的植株.将生根苗转入无植物激素的不同基本液体培养基里比较其生长效果,其中含有2倍大量元素的SH培养基最适合其生长繁殖,在2wk内可由1个小苗每秒殖出10个新的植株.本研究是关于该植物体外再生的首次报道.水浮莲体外再生及繁殖系统的建立不公可以用于在无菌条件下进行基础生理生化研究,还可以用于该植物遗传达室转化系统的建立.由于该植物生长迅速且为无性繁殖,生产成本低,通过基因工程方法表达外源基因将可以用于重组药用蛋白的生产及污染水体的转基因植物修复.     

麻疯树愈伤组织的诱导及快速繁殖

以麻疯树(Jatropha curcas)的种子、叶柄、叶片为实验材料进行愈伤组织的诱导及快速繁殖的实验．用不同浓度的BA和IBA对其不同外植体进行试验，发现用MS培养基加0．5mg／LBA和1mg／L IBA对叶片的效果最佳．在相同BA浓度处理条件下，减小IBA浓度会对下胚轴愈伤组织的出芽产生明显的效果．叶柄要求的浓度更低，0．1mg／L BA和0．1mg／L IBA为最佳．不定芽在无激素的MS培养基中进行生根培养，通过几天的练苗过程，就能转到土壤中生长．图1表2参13     

青蒿毛状根分支生长的动力学模型

近年来，用m质粒转化药用植物诱导毛状根生产有用代谢产物的研究日益增多，转化产生的毛状根不仅生长迅速，分支多，而且遗传性和生理、生化特性稳定，具有较强的次生代谢合成能力，因此可望应用于大规模生产有用的次级代谢产物［‘－’］．青蒿毛状根可产生大量的次生代谢产物     

In vitro mass multiplication of screw pines (<Emphasis Type="Italic">Pandanus</Emphasis> spp.) - an important costal bio- resource

An efficient in vitro mass multiplication protocol was developed for selected species of screw pine (Pandanus fascicularis Lam., P. furcatus Roxb.). The protocol could be successfully used for large scale production of planting materials leading to cultivation and making bio-fences or green belts in coastal areas, wetlands for protection and preventing soil erosion. This will facilitate the replenishment of the bio resource and also provide good breeding space for various fauna associated with it. For developing the tissue culture protocol, shoot tips and tillers from the mature plants were used as the explants. Surface sterilization with 0.1 % mercuric chloride for 1 min. Yielded good fraction (65 %) of contamination free explants. Explants inoculated in MS solid medium supplemented with 6-benzylaminopurine (BAP, 2.5 mg/l) and indole-3-acetic acid (IAA, 0.5 mg/l), induced 2–3 shoot buds in 5 weeks. These buds either individually or along with the explant portion, sub-cultured to fresh media containing the same hormonal combinations, resulted induction of 5–6 shoot buds in 4 weeks. Repeated subcultures of shoot buds in the same medium produced 8–10 shoot buds in every 4 weeks. Shoot elongation was achieved (~ 3 cm) by transferring the shoot clusters or individual shoots to basal medium, and the elongated shoots were rooted in vitro or ex vitro. Root induction in shoots (87.4 %) was achieved in MS medium supplemented with 0.1 mg/l indole-3-butyric acid (IBA). Rooted shoots were established in paper/polythene cups filled with fine sand, which subsequently recorded 85 % establishment under the shade-net house with proper irrigation. Plants grown in poly-bags were later successfully established in different field conditions and recorded 100 % survival.     

鞑靼荞麦离体再生体系的建立

研究了苗龄、外植体、激素配比对鞑靼荞麦(Fagopyrum tataricum Gaertn.)离体培养的影响,初步建立了鞑靼荞麦离体再生体系.结果表明,鞑靼荞麦离体再生的最佳取材时间为苗龄6～8 d;诱导愈伤组织的最适培养基为Ms+2.0 mg/L 2,4.D+1.5 mg/L 6-BA,子叶诱愈率达75%左右,下胚轴诱愈率可高达86.62%;愈伤组织分化的最适培养基为MS+0.1 mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L K1.+0.5 mg/L TDZ,来自下胚轴愈伤组织的分化率可达9.52%.下胚轴的诱愈率与分化率均高于子叶,更适于离体再生培养.培养基巾加入AgNO_3后,能有效降低褐化率.生根最适培养基为含有0.5 mg/L NAA的1/2MS培养基,生根率在50%左右.TDZ在诱导鞑靼荞麦的愈伤组织分化出芽的过程中起到明显的促进作用,可提高分化率约20%.表3图2参23     

雾化生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素

利用超声雾化生物反应器进行青蒿毛状根多层培养生产青蒿素．对超声雾化生物反应器中营养雾流动状况及毛状根生长过程的形态特征进行观察,并在合适的工艺条件下,经20d分批培养获得生物量10．3g／L,青蒿素产量179．1mg／L．     

流化床生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素

利用自制的流化床生物反应器进行青蒿毛状根多层培养生产青蒿素．对毛状根在生物反应器生长过程的形态特征进行观察,并在合适的工艺条件下,经２０ｄ分批培养获得生物量干重２１．３ｇ／Ｌ,青蒿素产量３４９．８ｍｇ／Ｌ,并对培养过程中底物消耗的动力学进行了研究．     

不同密度五种植物对薇甘菊幼苗的竞争效应

以入侵植物薇甘菊（Mikania micrantha H.B.K）和多年生植物高羊茅（Festuca elata Keng ex E.Alexeev）、黑麦草（Lolium perenne）、黄花蒿（Artemisia annua L.）、杂三叶（Alsike clover.）和紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为试验材料,温室条件下采用密度添加系列设计,研究了5种植物在不同密度下对薇甘菊幼苗的竞争效应,为薇甘菊生物替代提供理论依据。结果表明,（1）5种受试植物及其不同种植密度对薇甘菊幼苗的生物量、株高和分枝数具有极显著影响（P〈0.001）,但两者互作除对薇甘菊幼苗的株高显著影响外,对其幼苗的生物量和分枝数均无显著影响。（2）同等密度条件下,供试5种植物中的黑麦草和黄花蒿对薇甘菊幼苗的生物量、株高和分枝数的抑制作用最强,高羊茅次之,杂三叶和紫花苜蓿对薇甘菊幼苗的生长抑制作用最弱。（3）5种植物与薇甘菊混种组合中薇甘菊的相对产量（RY）均显著小于1,说明供试5种植物对薇甘菊的种间竞争作用强于其种内竞争;不同密度的黑麦草、黄花蒿和高羊茅与薇甘菊混种,3种竞争植物的竞争平衡指数（CB）均显著大于0;而杂三叶和紫花苜蓿仅在其与薇甘菊的混种密度分别大于200和300株/m2时,其竞争平衡指数（CB）大于0,而低密度时均小于0;说明供试5种植物中,黑麦草、黄花蒿和高羊茅的竞争能力强于薇甘菊幼苗,而杂三叶和紫花苜蓿在低密度条件下的竞争能力较薇甘菊幼苗弱。可见黑麦草、黄花蒿和高羊茅有望被作为替代竞争植物用来对薇甘菊进替代控制。