番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化

番茄HP1和HP2是色素积累的负调控因子,在光形态建成和色素积累调控中起着重要作用.将番茄HP1、HP2基因片段导入到植物表达载体pBI121,用番茄果实特异表达的TMF7基因的启动子替换原有的CaMV 35S启动子,构建果实特异表达HP1、HP2双基因RNA共干涉植物表达载体pBI121-TMF7-HP1HP2.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株果实内HP1、HP2的表达量均明显低于野生型植株果实.转基因植株果实叶绿素含量比野生型明显升高,而叶片中的叶绿素含量无明显差异.该研究结果为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路.图6表2参15     

番茄SIZ1-like1基因的克隆与功能

SUMO(Small ubiquitin-related modifi er)化修饰是植物体内一种重要的蛋白质功能调节方式.它调控植物细胞中蛋白的降解与定位,植物抗性及激素调节等.SIZ1是SUMO的E3连接酶并在SUMO化中起重要作用.为了解SIZ1基因在番茄中的功能,成功克隆番茄(Solanum lycopersicum)SIZ1基因(SIZ1-like1)并构建番茄SIZ1-like1RNA干涉和过表达载体后,通过农杆菌介导转入野生型番茄,成功获得6个独立的转基因阳性植株.荧光定量PCR(Real-time PCR)分析野生型番茄中SIZ1-like1基因的组织表达特异性,发现SIZ1-like1在植物的各个组织中都有表达.构建SIZ1-like1黄色荧光蛋白融合表达载体,通过对SIZ1-like1融合黄色荧光蛋白转基因番茄的根尖进行荧光显微观察,证实番茄SIZ1蛋白定位于细胞核.干旱胁迫实验分析显示,过表达转基因植株抗旱性强于野生型,且脯氨酸含量是野生型的3倍左右,而RNAi植株抗旱能力则较弱.因此SIZ1基因对番茄抗旱起到了正调控作用.     

BnGID1基因过量表达对甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1株高的恢复

在正常株高油菜中克隆了与拟南芥矮化突变相关基因AtGID1同源的BnGID1基因全长cDNA目的片段,将其正向插入表达载体pFGC5941上的CaMV35S启动子下游,构成该基因过量表达载体pFGC5941-BnGID1.经根癌农杆菌介导,导入甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1基因组,通过PCR及半定量RT-PCR检测,确定得到抗性转基因植株23株.移至大田生长,观察结果显示,转基因植株明显高于对照矮化突变体NDF-1,平均高出49.05cm.结果表明,BnGID1基因过量表达能够使甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1株高得到较大程度的恢复.图7表2参16     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化

以生菜(LactucasativaL.)为受体材料,将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体pLBI用农杆菌介导法进行遗传转化,获得47株转基因生菜植株.PCR和Southern-blotting检测证实目的片段在T0代的整合,RT-PCR检测表明目的基因的转录.T0代植株赖氨酸(Lys)含量的测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,比对照提高最高的可达9.46%.T1代植株PCR检测证明,目的基因能够遗传.图5表1参25     

水稻DDB1基因的表达特性及功能分析

利用RNA干涉技术构建水稻DDB1(Damaged DNA binding protein 1)基因不同启动子驱动植物表达载体,DDB1-RNAi和DDB1-glu-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入水稻愈伤,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,与野生型植株相比,两组转基因植株幼叶内DDB1的表达量...     

编码水稻胞外核苷酸双磷酸酶基因的表达特性

NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物巾分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉日的.在盐胁迫条件下,TO代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.图7表3参20     

干扰烟草GA 20-氧化酶siRNA植物表达载体的构建及矮化烟草的产生

根据烟草(Nicotiana tabacum)GA 20-氧化酶基因序列,设计2对分别含有特定酶切位点的特异引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增目的基因(约250 bp)片段.将正、反向目的片段分别插入中间载体的内含子两侧.再经BamH I和Sac I双酶切回收约700 bp的目的片段,插入到双元载体质粒p2355中,成功构建了含GA 20-氧化酶基因片段的反向重复序列植物表达载体p23700,其转录产物能形成发夹RNA(hpRNA),产生小分子干扰RNA,干扰目的基因的表达.将p23700质粒导入根癌农杆菌EHA105中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得表型矮化的转基因烟草.图4参14     

过量表达水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性(英文)

为了解水稻OsP5CS基因在非生物胁迫中的生物学功能及其生理生化作用,将P5CS基因的两个水稻同源基因OsP5CS1和OsP5CS2同时构建到植物表达载体pHB上,并通过农杆菌介导的遗传转化法转入烟草,经过鉴定转基因植株,成功获得9个独立的转基因阳性植株.选取野生型和其中的3个转基因植株后代,分别测定它们在不同的胁迫条件下幼苗的根长、鲜重以及脯氨酸、过氧化氢和丙二醛的含量.结果显示:在200 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇(Mannitol)、300μmol/L CuSO4胁迫条件下转基因植株的平均根长、平均鲜重、平均脯氨酸、平均过氧化氢含量和平均丙二醛的含量分别为野生型的1.3-2.3、1.9-3.9、1.8-3.2、51%-61%和62%-76%.因此在烟草中过表达OsP5CS基因,可以显著增加脯氨酸含量,降低烟草在非生物胁迫条件下的氧化损伤.图6参31     

水稻OsGPCR基因的克隆及遗传转化分析

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)基因家族是目前已知最大的膜受体超家族,参与生物的生长发育调控和激素应答.通过RT-PCR分离了水稻中一个具有7次跨膜(Seven transmembrane,7TM)结构域的OsGPCR候选基因;分析该基因启动子序列,发现它含有赤霉素GA应答相关元件.为分析其功能,分别构建OsGPCR过表达和RNA干涉载体,并通过农杆菌介导法转化获得转基因水稻植株.实验结果表明,较之野生型,过表达转基因植株对赤霉素反应更敏感,RNA干涉植株则反之.     

青稞B-hordein基因表达载体构建及对小麦的遗传转化

利用从具有特殊B-hordein亚基组成的青藏高原青稞材料中克隆的B-hordein编码基因(SL60)和小麦高分子量谷蛋白亚基胚乳特异表达启动子PGlu1Dx构建了真核表达载体pCB2007-SL60.通过农杆菌介导对普通小麦进行遗传转化,共获得227株再生植株,经PCR鉴定和转化片段测序验证,最终获得5株阳性植株.研究为进一步分析B-hordein基因在小麦背景中的遗传和表达,以及对小麦加工特性的影响奠定了基础.图5表2参21     

过量表达SlWD6基因增强番茄抗旱和耐盐功能

WD40蛋白广泛存在于真核生物体内,在生物体内协助细胞行使多种功能,目前关于WD40蛋白的研究多集中在拟南芥菜和水稻中.生物信息学分析显示,Sl WD6蛋白包含两个保守的WD-repeat结构域,属于WD40家族.为了解番茄中Sl WD6基因的功能,采用RT-PCR方法检测番茄的根、茎、叶、花和不同发育时期果实中Sl WD6基因表达量.利用RT-PCR方法获得Sl WD6基因全长,并且构建Sl WD6过量表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,利用Realtime PCR检测3个独立的转基因株系(WD6-393、WD6-418和WD6-421)中Sl WD6基因的表达量,并进行耐盐和抗旱性分析.结果显示,番茄Sl WD6基因为组成型表达,果实各时期表达量较高,在红果时期表达量达到最高;转基因株系中Sl WD6基因的表达量显著高于野生型;在干旱和高盐胁迫下,转基因植株叶片脯氨酸(Pro)含量显著高于野生型,丙二醛(MDA)含量与野生型相比则显著降低.用Na Cl和甘露醇介导耐盐和干旱胁迫,Sl WD6转基因植株T2代种子的根长和苗长显著高于野生型植株.综上,Sl WD6基因的过量表达能够显著增强番茄的抗旱和耐盐功能.     

HvABA8′OH-1基因RNAi载体的构建及遗传转化

穗发芽严重影响作物的产量和品质,种子休眠性弱是穗发芽形成的主要原因之一.ABA是维持胚休眠抑制萌发的重要激素,大麦HvABA8′OH-1基因编码控制内源ABA主要分解代谢途径的关键酶.以双元载体pGreenⅡ为骨架载体,分别选取HvABA8′OH-1的保守区序列(293bp)和特异区序列(474bp),水稻胚乳特异性启动子pGlub,成功构建了种子特异性RNA干扰表达载体pOHC和pOHS.利用农杆菌介导法将载体转入水稻,获得植株50株.经鉴定,其中18株为转基因阳性植株.研究结果为进一步分析HvABA8′OH-1基因的生物学功能,以及通过基因工程途径建立作物抗穗发芽育种新方法提供了理论依据和材料.     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

转基因烟草中赖氨酸含量的提高

采用叶盘法将高赖氨酸蛋白基因导入到烟草中.GUS组织化学染色、PCR扩增、Southernblot分析表明, 该基因已经整合到烟草基因组中.测定 10株转基因烟草叶片赖氨酸含量,大部分植株有着明显的提高,最高幅度达到了49. 89%. 图 6参 11     

拟南芥VTE1过量表达可以增加维生素E含量和提高烟草植株耐盐性

维生素E在动物细胞内具有抗氧化等重要作用,但在植物体内的功能却鲜为人知.本实验利用CaMV35S启动子与来源于拟南芥的编码生育酚环化酶(TC)的cDNA(VTE1)构建的嵌合表达载体,以根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草W38.实验结果表明,具有卡那霉素抗性的再生植株经RT-PCR检测,得到了与阳性对照一致的495bp的目标片段;转基因植株的VE含量比对照植株高2倍左右,个别株系高达11倍.实验还发现,在耐盐性实验中转基因植株对盐的抗性明显高于野生型烟草;同时,在不同盐浓度(150、250mmol/L)胁迫下转基因植株VE含量比未转化植株增加了1.3~1.8倍,首次证明VTE1与植物耐盐性之间的关系.图7参30     

异源表达胡杨PeCPD基因提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抗性

油菜素类固醇(Brassinosteroids,BRs)在调节植物生长发育和提高植物对非生物胁迫的抗性中起着重要作用,CPD(Constitutive Photomorphogenesis and Dwarfism)基因编码一种甾醇类23a羟化酶,在BR的生物合成中发挥着重要作用.本研究克隆胡杨Pe CPD基因的c DNA序列,并利用农杆菌介导法,将Pe CPD基因植物过表达载体p BI121-35S::Pe CPD转化野生型烟草,筛选得到Pe CPD基因过表达的转基因烟草植株,并利用Na Cl、高氮和甘露醇分别对转基因和野生型烟草进行胁迫处理,检测转基因烟草的耐受性和相关的生理生化指标.结果表明:(1)在正常条件下,转基因烟草的鲜重是野生型烟草的1.47倍;(2)在Na Cl、高氮以及甘露醇的胁迫处理下,转基因烟草植株的根长、叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于野生型植株,抗氧化酶SOD和POD活性以及渗透调节物质脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量也同样表现为转基因烟草显著高于野生型,而野生型植株的丙二醛(MDA)含量显著高于转基因植株.因此在烟草中异源过表达胡杨Pe CPD基因不但能够增加烟草的生物量,而且能够提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抵抗能力.     

水稻RBX1基因cDNA的分离及其过量表达载体对水稻的转化

RBX1蛋白是基于Cullin蛋白的E3复合体中的一个亚基,对于基于Cullin蛋白的E3复合体结合E2及Cullin蛋白的活化具有重要作用.利用RT-PCR分离到水稻RBX1cDNA,序列比对分析显示,水稻RBX1与拟南芥、人、果蝇及酵母中该同源蛋白的氨基酸序列一致性分别为80%、74.4%、72%和51.2%.酵母双杂交实验显示,水稻RBX1与水稻Cullin4蛋白有着相互作用.将水稻RBX1cDNA插入植物表达质粒pHB,利用农杆菌介导法将构建好的植物表达载体导入水稻,获得植株38株.以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段进行扩增,初步确定其中32株为转基因植株.图5表1参17     

香蕉几丁质酶基因ChiI2超表达载体和干涉表达载体的构建

分离克隆栽培香蕉中的几丁质酶基因ChiI2,构建超表达载体和干涉表达载体,可为进一步研究ChiI2基因响应抗逆胁迫的功能提供基础.从栽培香蕉天宝蕉(Musa spp., AAA)中克隆几丁质酶基因ChiI2,利用生物信息软件对该基因进行分析,并用无缝克隆技术分别构建ChiI2的超表达载体和干涉表达载体.从香蕉果皮中克隆到一个几丁质酶基因ChiI2,该基因全长942 bp,蛋白编码313个氨基酸,其编码的蛋白质理论分子量(Mr)为32.96,等电点(pI)为6.77.ChiI2蛋白的α-螺旋结构有6个,β-折叠结构有5个,转角结构有33个.蛋白质疏水性预测分析值为-0.233,属于亲水性蛋白.功能保守域分析表明,该蛋白是糖苷水解酶家族几丁质酶家族的一员.该基因核苷酸序列推导的氨基酸与野生香蕉、玉米、水稻、小麦、莲等植物的同源性都在70%以上.对ChiI2基因进行荧光定量PCR检测,发现4℃处理6 h的表达显著高于对照和38℃处理6 h,表明ChiI2基因可能与低温响应有关,诱导香蕉苗产生抗冷性.利用无缝克隆技术成功构建了pGreenII-ChiI2超表达载体和pGreenII-ChiI2i干涉表达载体,并转化到农杆菌EHA105菌株中.本研究成功地从栽培香蕉天宝蕉中分离克隆到了ChiI2基因,并对其基因特点和蛋白功能进行了预测分析,成功构建了超表达载体和干涉表达载体,可为进一步研究其功能奠定基础,也为采用基因工程方法改良选育香蕉抗寒品种提供了新尝试.(图8表1参24)