同源四倍体与二倍体水稻Wx基因位点的遗传差异

测定了中国科学院成都生物所培育出的14种同源四倍体水稻及8种大面积推广的二倍体水稻的直链淀粉含量，并利用微卫星标记484／485，Wxup2／485及PCR—AceⅠ分子标记对同源四倍体及二倍体水稻进行扩增．发现直链淀粉含量发生变化的部分同源四倍体水稻队基因位点发生变异，表明微卫星标记与同源四倍体水稻直链淀粉含量之间存在相关性，并初步探讨了同源四倍体水稻Wx基因位点遗传变异的原因．图2表1参13     

识别黄山药、穿龙薯蓣和盾叶薯蓣的分子标记建立

在对黄山药、穿龙薯蓣和盾叶薯蓣的psbA-trnH片段序列分析的基础上,根据3种薯蓣在该片段上的特征序列位点设计了用于识别3种薯蓣的寡核苷酸片段,并作为PCR反应的引物,将3种薯蓣的特征标记引物与psbAf-trn-Hr配合使用建立了识别3种薯蓣的显性和共显性两种检测方式,辅以NaOH碱法快速提取薯蓣干燥根茎总DNA,为3种薯蓣相互间快速、准确的鉴别创造了条件.图3表2参9     

水稻花药特异表达启动子的克隆与活性检测

植物雄性器官特异表达启动子的克隆是作物杂种优势利用分子育种的基础.根据水稻花药特异表达RA8基因序列设计引物,从水稻(Oryza sativa L.)品种日本晴中克隆得到水稻花药特异表达基因RA8启动子Tsp2,该启动子为RA8基因翻译起始位点上游828 bp的片段,具有启动子特征序列TATA盒TATAAATA和真核生物启动子特征序列CAAT框,与RA8启动子的核苷酸序列同源性为97%.利用该启动子与报告基因GFP构建植物表达载体p1304-rap,采用基因枪法转化烟草花药,通过GFP的瞬时表达证明该启动子具有花药特异启动子活性. 图5 参9     

大麦EST-SSR分子标记开发及特征分析

大麦是一种古老的栽培作物,也是分子遗传学研究中常用的模式植物,为满足大麦基因作图、遗传多样性、种质资源鉴定和分子辅助育种等研究的需求,拟在NCBI公共数据库基础上,开发基于表达序列标签(EST)的简单序列重复(SSR)分子标记.从NCBI数据库中获得了525 781条大麦EST序列,将这些序列进行聚类和去冗余后共获得61 902个Unigene,随后通过MISA软件搜索Unigene中的SSR位点,并设计引物9 659对,最后通过电子PCR(E–PCR)和普通PCR对引物进行验证.结果显示:(1)61 902个Unigene中含有SSR位点24 648个,其中复合SSR位点5 843个,约占3.42%,单纯SSR位点23 805个,约占96.58%;(2)经E-PCR验证后发现9 659对SSR引物中有1 060对(11%)能够成功扩增出产物;(3)随机选取的11对引物经普通PCR验证发现,这些引物都能在2份野生大麦品种、2份栽培大麦品种及1份小麦、硬粒小麦、荆州黑麦和节节麦中成功扩增.本研究表明日益丰富的EST公共数据库是大麦SSR分子标记的重要来源;利用EST公共数据库、SSR搜索软件,结合E–PCR验证是开发SSR分子标记省时高效的手段.     

小麦高分子量谷蛋白亚基基因的PCR及AS-PCR标记

选用高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)在Glu-D1位点已知的 26个普通小麦品种,包括 15个 (TriticumaestivumL. )川育系列品种及其 11个亲本,根据其亚基Dx5和Dy10基因的特异序列设计引物.通过对Dx5基因的PCR扩增及对Dy10基因的AS-PCR扩增,结果表明,所设计的引物对Dx5和Dy10都能扩增出特异条带,而携有Dx5基因的材料同时也携有Dy10基因.说明用所设计的引物可快速有效的鉴定出普通小麦中是否带有优质的 5 10亚基.图 4参 15     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.     

水稻总DNA的快速制备

采用两种不同的简单方法,均不接触有毒的有机试剂,且不需液氮速冻研磨,快速地制备水稻总DNA,用于SSR、STS等检测,效果稳定可靠.其中TritonX-100法提取的DNA具有很好的完整性,可用于后续其他分子生物学操作;NaOH法提取的DNA虽然降解严重,但是及时用于PCR及相关分析同样可行.两种方法均可在短时间内处理大批量的样品,操作简单,效果可靠,适于对杂种后代进行遗传连锁分析和分子标记辅助选育时的单株检测.图2表1参8     

水稻精细胞优势表达基因RSSG58的启动子克隆和功能鉴定

利用本实验室已经克隆的水稻精细胞优势表达基因RSSG58的cDNA序列与NCBI中的粳稻基因组文库进行比对、定位,结合生物信息学方法分析预测基因上游的启动子序列.在此基础上设计引物,以粳稻Oryzasativa(japonicacultivar-group)日本晴黄化苗总DNA为模板,采用DNA聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增出基因上游1093bp和462bp两个不同长度的启动子缺失片段(分别命名为JP58B和JP58S),测序结果显示,其具有大多数高等植物启动子的保守元件.进一步构建启动子片段的植物表达载体pBI121-JP58B和pBI121-JP58S,瞬时表达结果显示,两个启动子片段对报告基因GUS均具有启动活性.图4参20     

松材线虫PCR标准化阳性对照构建及检测体系的建立

建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196 bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100 ps/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.图3表2参8     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

砷污染土壤对不同品种水稻生长的影响

重金属如何影响水稻(Oryza sativa L.)的生长及产量一直是粮食生产中的研究重点。利用盆栽实验,首次比较了砷(As)对三个品系(杂交稻、常规稻和糯稻)共20个品种水稻生长的影响,以期选定适合在As污染区种植的水稻品种。结果显示,不同品系水稻在As污染土壤中的生长显著不同,杂交稻的生长优于糯稻和常规稻,但糯稻和常规稻差异不显著,表明杂交稻更适宜在砷污染土壤种植。同一品系内不同品种水稻的生长也有较大差异,杂交稻II优804的干物质积累量最高,每株达到0.055g。     

糯小麦回交改良群体中Wx基因的遗传和品质效应

在基因型鉴定的基础上,利用糯小麦杂交后代BC5F2代回交改良群体研究了各基因缺失对降低直链淀粉含量的效果和各基因合成直链淀粉的能力,以及直链淀粉含量与农艺性状、品质性状、淀粉糊化特性等的相关性。研究发现,在Wx基因的所有8种基因型之间,直链淀粉含量差异显著;研究单缺失基因型发现,对直链淀粉含量减少效应最大的是Wx-B1b,减少效应最小的是Wx-A1b,而Wx-B1b和Wx-D1b没有显著差异;研究双缺失基因型发现,Wx基因合成直链淀粉的能力以Wx-B1a最高,Wx-A1a最低,而Wx-B1a和Wx-D1a差异很小.直链淀粉含量与株高、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等农艺性状相关不显著,表明淀粉品质育种可以与高产育种实现有机结合.直链淀粉含量与SDS-沉降值呈显著负相关(r=-0.726),说明直链淀粉含量降低在一定程度上有利于提高小麦营养与加工品质.全糯类型的淀粉糊化特性与其他类型显著不同,具有最高的峰值粘度和稀懈值,最低的低谷粘度、最终粘度、反弹值、峰值时间、糊化温度、起始糊化温度,表明糯小麦淀粉在食品和工业上具有特殊用途;稀懈值与直链淀粉含量呈极显著负相关(r=-0.969),其它粘度参数与直链淀粉含量呈显著正相关(最终粘度r=0.797,低谷粘度r=0.910、反弹值r=0.954、峰值时间r=0.970、糊化温度r=0.962、起始糊化温度r=0.932).表5参37     

磷、砷双重胁迫对不同耐低磷水稻苗期生长及磷、砷吸收的影响

以1个耐低磷和1个低磷敏感水稻为材料,通过土培试验研究磷、砷双重胁迫对水稻苗期生物学特性及磷、砷吸收的影响,并比较不同品种之间的差异.结果表明,相同磷水平下,外加砷浓度为小于25 mg/kg时,水稻的生物量、叶宽、株高、SPAD值及磷吸收量均随砷浓度的增加而增加,当砷浓度达到50 mg/kg时开始下降,两个品种表现相同趋势.说明少量砷可以刺激水稻生长,促进磷的吸收,砷用量过多则抑制水稻的生长及磷的吸收.相同砷水平下,水稻生物学性状及磷、砷吸收量随磷用量的增加而增加,两个品种亦表现相同趋势.说明适当施磷肥可以缓解砷对水稻生长的抑制作用.上述结果表明,低浓度的磷、砷具有协同效应,高浓度的磷、砷表现拮抗作用.此外,相同磷、砷水平下,供试耐低磷水稻的生物学性状及其相对值较低磷敏感水稻大;但相对磷吸收量(除磷处理为150 mg/kg外)比低磷敏感水稻小,而砷吸收量及其相对值均比低磷敏感水稻多,这可能与二者的磷营养特性及水稻对磷和砷的竞争吸收有关.图7表1参19     

水稻基因类型与生长环境对精米中砷积累的影响

砷(As)是动植物非必需的有毒类金属。水稻是对As有较强吸收和富集能力的大宗粮食作物,大米的食用是我国及东南亚地区人体暴露As的最主要途径,严重威胁人体健康。水稻籽粒中As的积累与水稻的基因型及众多环境因子密切相关,而且表现出复杂的交互作用。在浙江省选择了不同土壤砷背景值的5块水稻田,同时在嘉兴市农科院布置了人工添加As的盆栽实验,比较了20个水稻品种在这6个实验点的精米中As含量。结果表明,水稻基因型与环境及其相互作用对水稻籽粒中As的积累均有极显著影响,并且筛选得到了5个精米中As含量较低的基因型:秀水128、秀水09、秀水134、甬粳16和Y-05-8。     

水稻根系吸收砷的动力学特征及硅的缓解机制（Uptake Kinetics of Arsenic Species in Two Genotypes of Rice Plants and Mitigatory Mechanism of Silicon）

采用室内模拟的方法,研究了两种基因型水稻(硅突变体和野生型)根系吸收As的动力学特征以及Si对水稻吸收As的影响.结果表明,两种基因型水稻根系对As(III)和As(V)的吸收均可以用Freundlich模型较好地模拟.外源Si的加入可显著降低水稻根系对As(III)和As(V)的吸收.在20μmol·L-1As处理下,与不加Si处理相比,加1.0mmol·L-1Si处理导致水稻根系吸收As(III)和As(V)分别降低94.1%和92.2%(野生型);74.4%和90.2%(突变体).在100μmol·L-1As处理下,水稻根系吸收As(III)和As(V)则分别降低64.5%和91.2%(野生型);76.1%和90.6%(突变体).     

不同虫压下转Bt基因水稻与非转基因水稻生态适合度差异

为了解转基因水稻的基因扩散效率和潜在生态风险,以转Bt抗虫水稻Bt63、R1、R2和非转基因常规水稻Ⅱ优838为试材,采用高、低两个不同虫害胁迫水平和转基因与非转基因水稻相间种植方式,通过观察水稻植株营养生长、结实以及对螟虫危害的抗性表现等差异,研究比较了Bt外源基因插入后对水稻植株适合度的影响.结果表明:在低虫害胁迫条件下,转Bt基因水稻在植株分蘖数、生物量鲜重等营养生长指标方面与非转基因对照品系间无明显差异,但株高、穗长、穗重等指标不及对照,且R2和Bt63与对照间差异显著;在高虫害胁迫条件下,3个转Bt基因水稻品系的分蘖数、穗长、穗重等指标明显高于对照.而不同转基因品系株高适合度效应不同,这可能与受体本身的特性相关.3种转基因水稻的单株结实粒数、千粒重与对照在两种虫害胁迫条件下均无显著性差异,Bt基因对受体植株的结实影响不明显.在高虫害胁迫条件下,3种转Bt基因水稻的抗虫能力均显著优于非转基因水稻,表明Bt基因对受体植株的抗虫性影响显著.同时,本研究结果还表明转Bt基因水稻的适合度代价较小,预示了抗虫转基因水稻外源Bt基因在一定环境条件下具有逃逸的可能,但这种风险比较小.     

磷胁迫对水稻基因型根系形态及吸收铁锰铜锌的影响

采用营养液培养方法研究了缺磷胁迫下4种水稻基因型(90-90—1、金23A、90-68-1、CDR22)的根系形态变化情况及其吸收微量元素铁、锰、铜、锌的影响。结果表明，(1)磷胁迫下，每个基因型在磷胁迫下其根系形态发生了明显变化、如根长、根冠比均呈增加趋势，并且根表有红棕色铁氧化物膜包被。(2)磷胁迫下根系形态的变化影响了水稻对生长介质中铁、锰、铜、锌的吸收：正常水稻植株中铁、锰、锌的含量高于磷胁迫植株，其中磷营养状况对水稻吸收铁、锰影响最明显；而磷营养状况对水稻植株铜含量的影响与铁、锰、锌正好相反，且影响程度较小。     

农杆菌介导的抗除草剂基因转入两系杂交稻恢复系的研究

利用农杆菌水稻高效转化系统，成功地将外源ＢＡＲ基因转入实用性两系要交稻恢复系Ｒ１８７和秀水０４，经过除草剂Ｂａｓｔａ田间涂布试验，其阳性率达到９０％以上。对转基因植株同步进行的ＰＣＲ特异扩增和总ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测结果也证实抗Ｂａｓｔａ的植株中含有ＢＡＲ基因。讨论了应用转ＢＡＲ基因的方法提高两系杂交水稻制种纯度的条件。图２表１参３     

矿区周围稻米重金属积累及健康风险分析

选用杂交稻、常规稻和糯稻3个水稻品系共21个水稻品种在广东大宝山矿区周围重金属污染土壤中进行大田试验,研究Cu、Zn、Pb、As和Cd 5种重金属元素在不同水稻品种(品系)稻米中的积累状况,并进行健康风险评价分析。结果表明,供试水稻稻米中Cd和Pb超标率很高,分别为100%和71.43%;Cu和As超标现象不严重,超标率分别为4.76%和14.29%;Zn含量均不超标。供试水稻品系中常规稻和糯稻稻米对Cu、Zn、Pb、Cd的积累能力较高,杂交稻则较低;但杂交稻稻米对As的积累能力高于其他2个品系。稻米中Cu、Zn、Pb、As和Cd含量与稻谷生物量均呈负相关关系,其中Pb含量与稻谷生物量呈显著负相关。供试水稻稻米对5种重金属的富集能力由高到低排序为Cd>Zn>Cu>As>Pb。本研究表明供试土壤中Cd和Pb对人体健康存在比较严重的潜在威胁,Cu、Zn和As对人体健康的潜在危害较小,应重点关注大宝山矿区稻米Cd和Pb的重金属污染问题及其对人体健康的潜在危害。     

Transferability of STS markers in studying genetic relationships of marvel grass (Dichanthium annulatum)

Transferability of sequence-tagged-sites (STS) markers was assessed for genetic relationships study among accessions of marvel grass (Dichanthium annulatum Forsk.). In total, 17 STS primers of Stylosanthes origin were tested for their reactivity with thirty accessions of Dichanthium annulatum. Of these, 14 (82.4%) reacted and a total 106 (84 polymorphic) bands were scored. The number of bands generated by individual primer pairs ranged from 4 to 11 with an average of 7.57 bands, whereas polymorphic bands ranged from 4 to 9 with an average of 6.0 bands accounts to an average polymorphism of 80.1%. Polymorphic information content (PIC) ranged from 0.222 to 0.499 and marker index (MI) from 1.33 to 4.49. Utilizing Dice coefficient of genetic similarity dendrogram was generated through un-weighted pairgroup method with arithmetic mean (UPGMA) algorithm. Further, clustering through sequential agglomerative hierarchical and nested (SAHN) method resulted three main clusters constituted all accessions except IGBANG-D-2. Though there was intermixing of few accessions of one agro-climatic region to another, largely groupings of accessions were with their regions of collections. Bootstrap analysis at 1000 scale also showed large number of nodes (11 to 17) having strong clustering (> 50). Thus, results demonstrate the utility of STS markers of Stylosanthes in studying the genetic relationships among accessions of Dichanthium.